transwell细胞迁移

迁移实验（cell migration assay）

实验材料

（1）Transwell小室，孔径8μm (Corning) ,细胞培养板24孔板 ,培养板应当与购买的Transwell小室相配套

（2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养,PBS，2.5?S （3）固定液：4%多聚甲醛固定液或者甲醇 （4） 染色液：Giemsa染液或结晶紫染色

（5）其他：小镊子，棉棒 1材料准备：

无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.2接种细胞

①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平； ②24孔板下室一般加入600μl含2.5?S的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了。 ③种板，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ④培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.3染色计数

①取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无菌的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。

② 0.1%结晶紫染色20 min，或Giemsa染色（5－10min，室温0.5h），用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。

③400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

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