茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶活性的变化规律及测定方法_孙云

热带作物学报

CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPS

Vol．29No．5Oct．2008

2008年10月

茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶活性的变化规律及测定方法孙

云1,2

江春柳1,2

赖钟雄1,2*

邵

巍1

福州福州

王秀英1,2

350002350002

1福建农林大学园艺植物生物工程研究所2福建农林大学园艺学院

摘

要

探讨茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定条件，分析不同茶树品种以及茶树鲜叶不同叶位

APX活性的变化。结果表明：聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)加入量约为鲜叶重的1.5倍，酶提取液pH为7.8，反应液pH为7.0，抗坏血酸(AsA)浓度为0.50mmol/L时茶树鲜叶APX活性最高；茶树鲜叶APX活性随冷藏时间的延长

呈下降趋势；福建7个主要茶树品种以福鼎大白茶的APX活性最高，铁观音的APX活性最低；茶树鲜叶不同叶位APX活性变化趋势为：芽>第一叶>第二叶>第三叶>老叶>嫩茎。关键词

茶树

鲜叶

抗坏血酸过氧化物酶（APX）酶活性

测定方法

中图分类号

S571.1

抗坏血酸过氧化物酶（也称维生素C过氧化物酶，是植物细胞中防御外界氧化胁迫和植物本身活APX）性氧代谢的重要抗氧化酶类，在降低H2O2对植物细胞产生氧化损伤方面起关键作用。要使APX发挥正常的催化功能，及时清除H2O2维持叶绿体正常的功能，必须有抗坏血酸（存在。AsA既是催化反应的还原AsA）剂，又是APX活性的稳定剂[1]。但AsA在人体组织内不能自行合成，只能从体外获得[2]。茶叶中的维生素含量高，种类多，饮用绿茶对人体补充AsA的作用很大，但AsA在茶叶加工和储存过程中容易大量损失。自1976年APX的发现至今30多年来，前人对APX的酶学特性、分布、定位、作用机制、生理功能及分子生物学特征等方面作了不少研究，Chen等[3,4]根据茶叶cDNA推断出cAPX的整个氨基酸序列，从茶叶中亦得到了sAPX。但对APX活性测定方法的研究还比较少。本文探讨了不同因素对茶树鲜叶APX活性的影响，建立了茶叶APX活性的测定方法，并利用此方法分析了冷藏条件下以及不同茶树品种、鲜叶不同叶位APX活性的变化规律。

11.1材料与方法

材料和仪器

试验材料：福鼎大白茶、福云6号、黄旦、本山、毛蟹、肉桂、铁观音，采自福建农林大学茶园。试验仪器：台式高速冷冻离心机、T6新世纪紫外可见分光光度计等。

1.21.2.1试验方法

APX活性的测定参照文献[5]的方法并加以改进。

酶液的制备

称取0.5g的茶树鲜叶剪碎，加入适量的石英砂、聚乙烯聚吡咯烷酮（和7.5mLPVPP）

酶提取液，在冰浴中充分研磨，离心（取上层清液1mL，分装于小离心管中置于10000×g、4℃、20min）

4℃备用或-20℃保存。

1.2.2APX活性的测定提取液：50mmol/LPBS(磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液)，pH7.8；2mmol/L

AsA；5mmol/LEDTA。反应液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/LAsA；0.1mmol/LEDTA。

福建省果茶重大科技专项（编号：2004NZ-02-3）资助。

孙云女，1964年生，副教授，研究方向：茶叶加工与生物技术。E-mail：sunyun1125@126.com。*通讯作者赖钟雄，E-mail：laizx01@163.com。收稿日期：2008-04-02修回日期：2008-08-08

５期孙云等：茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶活性的变化规律及测定方法５６３

在3个比色皿中各加入20μL鲜叶APX粗酶液，再加入3mL反应液；1号比色皿中不加AsA和H2O2

作为参照；2号比色皿中不加H2O2作为控制参照；3号比色皿中加入0.1mmol/LH2O2启动反应；每10s连续记录室温下290nm吸光值的变化X。室温下每一分钟氧化1μmolAsA的酶量作为一个酶活性单位（。U）

1.2.3计算公式每克鲜叶APX的酶活性/U=(X×7.5×1000×60×1000)/(m×2.8×20×10)。公式中各项依次为

X：OD值的变化；7.5：每克材料提取7.5mL粗酶液；1000：将mL转换成μL;60：将1min转换成60s；1000：将mmol转换成μmol；m：鲜叶的重量，单位为g；2.8：吸光系数mmol·L-1/cm；20：用20μL酶

液进行活性测定；10：每10s记录吸光值的变化。

1.31.3.11.3.21.3.31.3.41.3.51.3.6试验处理

不同量的PVPP对鲜叶APX活性的影响

福鼎大白茶鲜叶研磨时分别加入0.50、0.75、1.00g的

福鼎大白茶鲜叶研磨时采用不同pH（7.0、7.8）

PVPP，按上述方法提取粗酶液并测定APX活性，以不加PVPP的作为对照。

不同pH提取液、反应液对鲜叶APX活性的影响不同底物浓度对鲜叶APX活性的影响

的提取液，所提粗酶液与pH（的反应液反应，测定APX活性。7.8、7.0）

取20μL福鼎大白茶的粗酶液，分别加入不同浓度（0.25、

将福鼎大白茶鲜叶放在-40℃下冷冻储藏2、4、6、8、

的AsA反应液，测定APX活性。0.50、1.00mmol/L）

鲜叶冷冻储藏天数对鲜叶APX活性的影响不同茶树品种APX活性的比较鲜叶不同叶位APX活性的比较

10、12、14d后，测定APX活性。

分别称取0.5g福鼎大白茶、福云6号、黄旦、本山、毛蟹、肉以福鼎大白茶、福云6号、黄旦、本山、肉桂、铁观音的芽头、

桂、铁观音的一芽一叶，测定APX活性，比较不同茶树品种APX活性的差异。

第一叶、第二叶、第三叶、老叶、嫩茎为原料测定APX活性，比较不同叶位APX活性的变化。

22.1结果与分析

鲜叶APX活性的测定方法不同量的PVPP对鲜叶APX

提取酶液时，加入不

0.00

󰀂󰀃󰀄/U/g

0.00 ±0.00d

0.50 13245.68 ±212.13b

2.1.1󰀁1 󰀂󰀃󰀄󰀅PVPP󰀆󰀇󰀈APX󰀉󰀊󰀅󰀋󰀌

PVPP󰀁/g

0.75 23027.99 ±353.56a

1.00 12084.90 ±132.94c

活性的影响

同量的PVPP对酶活性有显著影响（表1）。不加PVPP研磨时，APX失活检测不到活性，这是由于茶叶中含有蛋白质的变态剂多酚类物质的

󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌5󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀖󰀗󰀘󰀊󰀓󰀙󰀐󰀚󰀛󰀜󰀝󰀞󰀈󰀛󰀟 !\"󰀕# 0.05$󰀑%&’()󰀗*(+󰀛),

缘故。随着PVPP量的增加，酶活性提高，当PVPP量为鲜叶重的1.5倍时，酶活性达到最高，继续加入

PVPP到鲜叶重的2倍时，酶活性不再提高。加入不同量PVPP提取液的酶活性差异达到了显著水平。这

表明从茶树鲜叶中提取APX时，加入鲜叶重1.5倍的PVPP效果最好。

2.1.2不同pH提取液、反应液对鲜叶APX活性的影响酶液提取时，提取液的pH对APX活性有一定影响，但反应液的pH对其影响较大（表2）。当反应液pH为7.0（组合A、B）时，提取液pH7.8APX活性最

高，提取液pH7.0APX活性降低，两个组合间的酶活性差异显著。当反应液pH为7.8（组合C、D）时，

APX活性明显降低，2个组合间酶活性的差异不显著，但与反应液pH为7.0（组合A、B）的APX活性相

比，差异达显著水平。提取液pH为7.8，反应液pH为7.0时，APX活性最高；提取液pH为7.8，反应液

󰀁󰀂󰀃󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀊󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀖󰀗󰀘󰀃

󰀁󰀂󰀃󰀄

A B C D

󰀅󰀆󰀇pH 7.8 7.0 7.0 7.8

󰀈󰀉󰀇pH 7.0 7.0 7.8 7.8

󰀊󰀋󰀌/U/g 24770.25±153.61a 23634.45±221.34b 17231.48±207.01c 16769.92±525.03c

pH为7.8时，APX活性最低。因此在测定鲜叶APX

活性时选用“提取液pH为7.8，反应液pH为7.0”的A组合最好。

５６４

热带作物学报

不同底物浓度对鲜叶APX活性

，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，

󰀃󰀄󰀅/U/g

0.00 0.00±0.00d

0.25 20154.67±282.84b

AsA󰀁󰀂/mmol/L

0.50 24770.25±254.58a

1.00

29卷

2.1.3的影响APX是以AsA为电子供体的

一种专一性很强的过氧化物酶，本试验是通过测定反应底物AsA的降低来计算鲜叶APX活性，AsA浓度对APX活

18154.59±141.42c

性的影响较大(表3)，不同AsA浓度下APX活性的差异达显著水平。当AsA浓度为0.50mmol/L时，APX活性最高，活性为24770.25U/g；当浓度为0.25mmol/L时，APX活性也比较高，但是该组吸光值都小于

1；当浓度增大到1.00mmol/L时，APX活性下降了1/4，出现底物抑制现象。这表明AsA浓度为0.50mmol/L时，测定鲜叶APX活性的效果最好。

上述试验结果表明，测定茶树鲜叶APX活性的最佳条件为：PVPP的加入量为鲜叶重的1.5倍，提取液pH为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为0.50mmol/L。在测定APX活性时应注意以下几点：(1)由于测定反应是通过测定反应底物AsA的降低来计算APX活性，因此所加的酶量一般不宜过大，应使加液量控制在60s内，使产生的A290值下降呈良好的线性关系。(2)由于此反应中AsA和H2O2量都很少，可以将30％的H2O2稀释500倍，在测定时直接吸取15μL的H2O2与3mL反应液加入到比色皿中，启动反应。

(3)H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内可以忽略不计。

2.22.2.1鲜叶APX活性的变化规律

鲜叶冷冻贮藏天数对茶叶APX活性的影响

酶活性极易受到环境影响，试验中常采用低温的方法

保存材料。为探明冷冻贮藏天数对鲜叶APX活性的影响，每隔2d测定冷冻在-40℃条件下福鼎大白茶鲜叶

见表4）。鲜叶冷冻2d后APX活性下降最快，与0d比较差异达显APX活性，其活性变化总体呈下降趋势（

著水平；冷冻4、6、8d的鲜叶APX活性维持在相对稳定水平，差异不显著；冷冻10d后APX活性下降幅度较大，其中冷冻12、14d差异不显著。因此，测定鲜叶APX活性时应尽可能保持芽叶的新鲜度。

󰀁󰀂󰀃󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀅󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀃

󰀁󰀂󰀃󰀄/d

0 2 4 6 8 10 12 14

󰀅󰀆󰀇/U/g 24 770.20±329.49 a 18 270.02±216.69 b 17 782.20±267.91 bc 17 680.09±536.55 bc 17 380.44±249.03 bc 13 979.08±580.29 cd 13 208.97±296.52 d 11 164.93±181.54 d

󰀁󰀂󰀃󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀃

󰀁 󰀂 󰀋󰀌6󰀍 󰀋󰀏󰀐󰀑󰀒 󰀓󰀔 󰀕󰀖 󰀗󰀘 󰀙󰀚 󰀛󰀜󰀝

󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇/U/g 34 563.89󰀎60544.15 39 225.29󰀎44332.84 35 139.54󰀎40217.85 34 244.43󰀎38941.69 32 235.85󰀎37100.06 32 209.01󰀎35433.56 29 522.45󰀎30942.84

󰀈󰀉󰀊/U/g 45 354.87±325.47 a 42 058.32±219.61 ab 37 522.13±476.54 bc 36 800.06±213.64 bc 34 378.78±860.78 bc 34 107.40±309.96 bc 30 287.18±716.85 c

2.2.2不同茶树品种APX活性比较

通过测定福建主要的茶树品种福云6号、福鼎大白茶、肉桂、毛蟹、

黄旦、本山和铁观音的APX活性，结果表明(表5)，绿茶品种（的APX活性高于乌福云6号、福鼎大白茶）龙茶品种（肉桂、毛蟹、黄旦、本山和铁观音），差异都达到显著水平，其中福云6号的APX活性高于福鼎大白茶；乌龙茶品种中肉桂、毛蟹、黄旦、本山的APX活性差异不显著，铁观音的APX活性最低。

2.2.3鲜叶不同叶位APX活性比较对福云6号、福鼎大白茶、肉桂、黄旦、本山、铁观音6个品种不

同叶位APX活性测定结果显示（表6），芽的APX活性最高，嫩茎的APX活性最低，芽的APX平均活性为嫩茎的3.68倍。鲜叶不同叶位APX活性变化达显著水平，总趋势为芽>第一叶>第二叶>第三叶>老叶>嫩茎。表明随着鲜叶成熟度增加，APX活性下降，鲜叶APX活性受其生长程度的影响。

3讨论

茶叶中富含多酚类物质，在细胞破碎后，多酚类物质会在内源多酚氧化酶的作用下形成茶褐素，这些

５期孙云等：茶树鲜叶抗坏血酸过氧化物酶活性的变化规律及测定方法５６５

󰀁󰀂󰀃󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀄󰀅󰀊󰀋󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒 /U/g

󰀃 󰀄 󰀘

󰀁 󰀂

󰀅󰀆6󰀇

󰀅󰀈󰀉󰀊󰀋

󰀌󰀍

󰀎󰀏

󰀐󰀑

󰀒󰀓󰀔

󰀕󰀖󰀗

73 471.47󰀙317.98a 75 086.30󰀙332.33a 68 238.17󰀙204.51a 61 849.60󰀙458.93a 57 899.59󰀙453.35a 45 802.81󰀙172.58a 63 724.66󰀙10982.70a

󰀚󰀛󰀃 58 542.95󰀙472.41b 54 284.50󰀙235.70b 45 634.14󰀙301.22b 36 057.41󰀙456.11b 48 204.88󰀙200.98b 62 838.52󰀙421.34b 50 927.07󰀙9671.49b 󰀚󰀜󰀃 50 212.93󰀙681.22b 41 997.46󰀙171.72c 44 501.58󰀙598.29c 33 490.70󰀙508.18b 31 685.10󰀙590.67c 46 574.60󰀙352.13c 41 410.39󰀙7366.91c 󰀚󰀝󰀃 38 202.79󰀙627.55c 30 186.66󰀙23.78d 44 501.58󰀙256.24d 27 444.25󰀙359.98c 30 124.15󰀙402.32c 36 434.36󰀙308.39d 34 482.30󰀙6403.42cd 󰀞 󰀃 32 343.77󰀙212.58c 28 910.49󰀙146.30d 33 632.76󰀙97.66e 26 063.81󰀙429.65c 29 419.95󰀙681.76d 33 710.80󰀙279.92e 30 680.26󰀙3056.17d 󰀟 16 146.95󰀙740.79d 19 337.18󰀙635.51e 23 470.10󰀙179.54f 13 137.06󰀙559.70d 17 102.25󰀙486.34e 14 845.67󰀙193.62f 17 339.87󰀙3658.77e

色素的共价键吸附蛋白，使许多酶失活[6]。茶叶中多酚类物质强烈的抑制酶活性，在酶提取过程中加入多酚吸附剂，则能有效防止多酚类物质对酶蛋白的凝固沉淀作用[7]。所以在提取APX时，要加入一定量的多酚类吸附剂如PVPP，否则APX就会失活，无法检测到其活性。但如果加入过量的吸附剂PVPP也会抑制

APX活性。试验结果表明，从茶树鲜叶中提取APX时，加入鲜叶重1.5倍的PVPP效果最好。测定酶活

性进行酶液提取时，缓冲液的选择是非常关键的第一步。试验结果表明，提取APX时，采用pH为7.8的·K2HPO43H2O-KH2PO4缓冲液能获得较高的APX活性。测定APX活性是通过测定底物AsA的降低来计算酶活性，AsA在290nm处吸光值很小，可以忽略其对结果的影响。一定的AsA浓度是保证APX活性的前提条件，但是浓度太高反而会抑制其活性，AsA浓度为0.50mmol/L时，APX活性最高。

APX作为清除叶绿体中H2O2的毒害作用，维持植物正常光合作用的关键酶，其活性受到多种环境因

9]

素的影响。将鲜叶放在-40℃下冷藏2d，APX活性就下降了1/4。曾韶西等[8，研究发现，黄瓜幼苗子叶在低

温胁迫下，APX活性显著下降，下降幅度随低温程度增加而递增；在低温光照处理时，APX在开始24h活性有下降趋势并与叶绿素含量的降低有一定关系。刘家忠等[10]研究发现，在强光下AsA的转换较快，

APX活性提高，减小植物在强光下的伤害。APX在热休克、盐渍等逆境条件下其转录水平及酶活性都提

高了[11]。总之，植物生长的诸多环境因素(如缺水、低温、强光等)都可能对植物的光合作用产生不同程度的影响，作为叶绿体分解H2O2系统关键酶的APX也受到很多环境因素调控。但不同植物中APX对各种环境因素的反应并不一致，这表明不同种类植物中APX作用的生理基础、对生长环境的敏感性可能会有所不同。这意味着APX有可能成为作物抗逆性育种研究者考虑的一个生理生化指标[12]。

茶叶APX活性还受到茶树自身生长因素的影响，随着新梢生长成熟，APX活性逐渐下降。同一茶树品种叶龄不同，其APX活性也不同。鲜叶APX活性总体的变化趋势为：芽>第一叶>第二叶>第三叶>老叶>嫩茎。不同茶树品种APX活性也存在差异，绿茶品种APX活性高于乌龙茶品种。但对于APX活性是如何受叶龄的影响，有待进一步的研究。

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DeterminationandObservationoftheChangesof

theAscorbatePeroxidaseActivitiesintheFreshLeavesofTeaPlants

SunYun1,2JiangChunliu1,2LaiZhongxiong1,2

ShaoWei1WangXuiyin1,2

1InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou3500022CollegeofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002Abstract

Theascorbateperoxidaseactivitiesinthefreshleavesofteaplantsweredeterminedandtheir

optimumconditionsfordeterminationdiscussed.Thechangesoftheascorbateperoxidaseactivitiesinthedifferentteacultivarsandonthedifferentleafpositionsofthefreshleafwereobserved.TheascorbateperoxidaseactivitiesintheteafreshleaveswerethehighestwhendeterminedundertheconditionsthattheweightofPVPPaddedwas1.5timesoftheweightoffreshleaf,thatthepHwas7.8forextractionsolu－tionand7.0forreactionsolutionand,thattheAsAconcentrationwas0.50mmol/L.Theascorbateperoxi－daseactivitiesinteafreshleavesshowedatendencytodecreasealongwithcoldstorageduration.TheteaFudingDabaichawasthehighestinascorbateperoxidaseactivitiesamong7majorteacultivarsinFujianProvince,whileTieguanyinwasthelowest.Theascorbateperoxidaseactivitiesintheteachangedwithleafpositionsintheorderofthebud>thefirstleaf>thesecondleaf>thethirdleaf>theoldleaf>theyoungstem.

Keywordsteafreshleaf

ascorbateperoxidaseenzymaticactivity

determination