2014级分子生物学考试答案, - 副本

江西农业大学 2014 级硕士研究生 《高级分子生物学》课程考试试卷

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1、 何谓基因、基因组？各种模式生物体的基因组大小和基因数有何规律？ 在分子生物学中，基因是一段携带功能产物（多肽、蛋白质、tRNA、rRNA、和某些小分子RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的遗传单位。基因一般由结构基因和调控基因序列构成，结构基因编码多肽链或者RNA部分，调控序列位于基因 编码区两侧，与转录调控有关。基因组是指生物体的一套完整的单倍体遗传信息。通常在计算基因组大小的时候以DNA含量（全部DNA的碱基对总数）来表示。

从几种模式生物的基因组大小和数据数来看 物种 人 实验小鼠 拟南芥 圆线虫 果蝇 酵母 大肠杆菌 支原体 乙肝病毒 基因组大小 30亿 26亿 1亿 0．97亿 1.37亿 0.12亿 460万 58万 3200 基因数 30000 30000 25000 19000 13000 6000 3200 480 4 其中可以看到基因组大小随着生物的复杂和进化程度越高基因组就越大，几乎成正比例关系，基因数由于生物基因组的结构特征的差异人和实验小鼠的基因组数相差3亿但是基因数却几乎相同，因此可以看出生物进化程度与基因大小不完全成比例。

2、什么是致死基因座（Lethal loci）？如何鉴定？生物体的进化程度与

致死基因座的变化有何规律？

2、 试述核小体的基本组成，核小体任何包装成染色单体？

核小体是染色质的重复单元，它由200对碱基和组蛋白H2A、H2B、H3及H2各两个分子和H1一个分子所组成。每一种组蛋白各

3、 比较原核和真核生物DNA复制的差异；设计一个实验证明DNA的复制是“双向”进行的。

原核生物每个细胞都只含一个染色体，真核生物每个细胞常含多个染色体。在原核和真核生物DNA复制中都需要有复制模板、4种脱氧核苷三磷酸为原料，一段小RNA作为引物，ATP、无机离子、各种酶和蛋白因子。但是在复制过程中原核生物和真核生物所需的引物、酶和蛋白因子存在一定差异。首先他们所需的DNA聚合酶种类有差异，原核生物DNA聚合酶是由DNA-pol I，DNA-pol II，DNA-polIII 三种酶组成，其中polIII用于新链的延伸。真核生物DNA聚合酶有5种组成，包括DNA-pol，、、、五种组成，其中用于线粒体DNA复制，用于延长新链。DNA的复制起始阶段，原核生物形只有一个复制起点，起始识别点为DnaA，引物长而多，多为双向复制，形成复制叉。真核生物有多个复制起点，形成多个复制单位，引物短且少，复制反向多为双向复制。复制的终止，原核生物DNA为环状，真核生物为线性因此在真核生物中DNA的复制和核小体的装配同步进行。

通过放射自显影的实验可以判断DNA的复制是双向进行的，在复制开始时，先用低放射性3H-脱氧胸苷标记大肠杆菌，数分钟后，再转移到含有高放射的3H-脱氧胸苷培养基中继续进行标记，这样，在放射自显影图像上，复制起始区的放射性标记密度会比较低，感光还原的银颗粒密度就较低，继续合成区标记密度较高，银颗粒密度也较高，若是单向复制，银颗粒密度分布就会一端高一端低，若是双向则是中间低，两边高。 4、 简述动态突变性遗传病的DNA动态变化规律。

由于脱氧三核酸串联重复的拷贝数大大增加所致，这种拷贝数增加的变化会随着世代的传递而不断扩大、扩增，故被认为是一种动态的突变，在人类细胞中，当动态突变发生在转录序列内或者附近时，就有可能对基因转录或其表达产物产生影响，从而表现出疾病症状，他所导致的疾病就被称为动态突

变性遗传病。

动态突变的产生是一个多步骤的过程，包括重复拷贝数或者碱基组成发生低频率的、少量的变化，从而产生相对不稳定数量的完全重复序列。动态突变的一般规律有：1、突变率与完全重复拷贝数有关2、等位基因中的完全重复拷贝数的增加是由一些发生频率低的碱基组成变化累积形成，3、在重复拷贝数与发病年龄以及与治病严重程度之间具有相关性。由于动态突变具有上述这些特性，所以由动态渡边所致的遗传病，具有驻代增加发病率或治病严重性的特点。

5、 在研究过程中 发现一个可能的真核转录延伸的负调控因子命名为TFⅡNENG（已拿到其全长cDNA），设计实验计划研究其功能，并给出可能出现的实验结果

在发现的对于可能的负调控基因功能研究中，首先根据其全长cDNA的保守序列分析设计引物进行扩增并且克隆进具有真核生物表达系统的宿主菌中，我们选择酵母菌。

1）最直接的方法就是把你的cDNA连接到表达载体中，然后转化酵母中表达，然后检测所表达的蛋白质的功能；

根据实验需要选择合适的表达载体。选择强启动子,与报告基因组成融合蛋白。2.根据表达载体的多克隆位点选择合适的限制性内切酶位点，确保cDNA序列中没有这些位点。3.设计带有这些酶切位点的PCR引物，以cDNA为模板，扩增其编码序列。需要绝对注意的问题：如需表达融合蛋白，切记不能让插入片段（报告基因在前）或插入片段以后（报告基因在后）的序列发生移码。可通过在引物上添加补齐碱基来解决。其它需要注意的：引物5‘端至少加3个保护碱基，否则下一步无法进行。4.PCR产物和载体质粒同时用对应限制性内切酶进行切割，回收酶切产物。5.插入片段和线性化载体按3：1的比例，使用T4DNA连接酶进行连接。4度过夜。重组DNA分子导入酵母中，筛选。观察酵母生长情况发现含重组DNA的酵母生长情况不太好。

2）通过基因敲除（knockout）的方法来研究基因的功能；敲除掉这个基因后，做一个northern来分析体系中的mRNA的量。以小鼠为实验对象，敲除掉这个基因后观察老鼠的生长情况发现相比于没有敲掉的小鼠生长更好

3）设计siRNA,通过RNA干扰技术来研究基因的功能。同样以小鼠为研究对象，这个基因沉默以后发现生长情况比没有沉默的好。

7、细菌的半乳糖operon在存在glucose时仍然可以被诱导，试解释之。并说明其对细菌正常生理过程的意义。

大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括3个结构基异构酶

(UDP-galactose-4epimerase,galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT)，半乳糖激酶(galactose kinase, galk)。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。gal操纵子的特点：

1.它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； ② 它有两个O区，一个在P区上游-67--53，另一个在结构基因galE内部 因为半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人们猜想葡萄糖存在时半乳糖操纵子不被诱导，但实际上有葡萄糖存在时，gal操纵子仍可被诱导。

分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子确实存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。

从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。

从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，当无cAMP-CAP时，转录从S2开始

半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶。

假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。

8、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样才能阐明该基因的功能？请你根据自己熟悉的某种真核生物提出具体的研究方案。

在获取到一段未知基因克隆后，首先对未知功能的基因片段进行测序，将得到的测序片段在基因数据库中进行BLAST同源对比，根据同源对比结果进行基因功能的预测，并对得到的基因序列进行分析解读，可大致的根据生物信息学的比对和推测进行基因功能的预测和推断。

在对其未知功能基因的推断之后，需通过基因的表达和表型变化才能具体阐明该基因的功能。通过软件分析基因序列片段后，根据其相关的限制性内切酶序列，和酵母表达载体的序列对比，找出合适的限制性内切酶，进行酶切、连接构建重组质粒，并通过转化导入到宿主菌内进行表达。如若未知基因内无合适限制性内切酶片段，可根据保守序列分析设计PCR引物引入限制性酶切位点，再通过酶的剪切、连接构建重组质粒并转化导入酵母菌宿主内，可根据重组工程菌与原始菌株的表型变化来判断和阐明该基因的功能。