水稻TWH基因RNAi载体的构建及遗传转化

李进波;查中萍;万丙良;戚华雄

【摘 要】According to the principles of RNAi vector construction, a 253 bp fragment targeting at TWH gene was inserted into the expression vector pR1301 in both forward and reverse directions; and RNAi expression vector pR1301-TWH was

constructed*

Through

the

method

of

Agrobacterium-mediated

transformation, the expression vector was used to transform japonica rice cultivar Wuyujing 3; and 34 positive transgenic plants were gained. This result will provide a good background to study the function of TWH gene.%根据RNAi表达载体的设计原则,以TWH基因为靶基因,将长度253 bp目的片段通过正反两个方向插入表达载体pR1301中,构建RNAi表达载体pR1301-TWH.通过根癌农杆菌EHA 105介导法将其导入水稻品种武育粳3号,获得34株阳性转基因植株,为进一步深入研究TWH基因功能奠定了基础.

【期刊名称】《湖北农业科学》

【年(卷),期】2012(051)024

【总页数】3页(P5791-5793)

【关键词】水稻(Oryza sativa L.);TWH基因;RNAi(RNA interference);载体构建;遗

传转化

【作 者】李进波;查中萍;万丙良;戚华雄

【作者单位】湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉4300

【正文语种】中 文

【中图分类】S511;Q781

RNA 干涉（RNA interference，RNAi）是指内源性或外源性双链 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）介导的同源mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默从而产生相应的功能表型的缺失现象，属于转录后的基因沉默现象。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫中被首次发现［1］，利用这一技术可以有效、特异性降解靶标基因mRNA，阻止靶标基因的表达，从而研究目标基因的功能。

目前，水稻中已有许多利用RNAi技术进行基因功能分析或验证的报道［2－4］。从水稻育种后代材料中发现一个水稻颖壳扭曲突变体，该突变体主要表现为颖壳扭曲变形，子粒充实不饱满［5］。进一步的研究结果表明，该突变体颖壳扭曲性状受一对隐性基因控制，其对应的TWH基因被精细定位在第二染色体的SSR标记RML25和RML35之间，两个SSR标记间的物理距离为11.9 kb，并确定了其候选基因。该研究通过构建水稻TWH基因的RNAi表达载体，利用根癌农杆菌EHA105介导法将其导入水稻品种武育粳3号中，获得了转基因水稻植株，为TWH基因的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

高保真Taq酶、dNTPs、各种性内切酶、T4连接酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表1。

1.2 载体及菌株

RNAi载体pR1301由双元植物表达载体pCAMBIA1301和双链RNA载体pMCG161改造而成，结构如图1所示（由湖北省农业科学院植保土肥研究所袁斌博士惠赠），pMD18－T载体购自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌EHA105购自天根生化科技（北京）有限公司。

表1 本研究所用引物序列?

图1 RNAi载体结构示意图

1.3 植物材料和遗传转化方法

供试水稻材料为武育粳3号成熟种子诱导初生愈伤组织，作为与农杆菌共培养转化的受体材料。水稻的组织培养、农杆菌介导转化水稻以及抗性愈伤组织的筛选与植株再生等参照刘巧泉等［6］建立的高效转化方法进行。

1.4 PCR引物设计及目的片段扩增

根据TWH基因的 cDNA序列由Primer 3.0引物设计软件设计特异引物P1与P2（引物序列见表1），以武育粳3号总DNA为模板，用P1与P2进行PCR扩增，预期的目的片段大小为253 bp，PCR反应体系为：1.5 μL 10×PCR Buffer （100 mmol／L Tris－HCl，pH8.3；500 mmol／L KCl；15 mmol／L MgCl2），1.2 μL dNTPs （2.5 mmol／L），0.6 μL 上游引物（10 μmol／L），0.6 μL 下游引物 （10 μmol／L），0.2 μL Taq酶 （5 U／μL），1 μL 模板 DNA，加 ddH2O 至15 μL。PCR反应条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5 目的片段的克隆

将目的片段切下，通过胶回收试剂盒回收PCR产物并纯化后连接到pMD18－T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含100 mg／L氨苄青霉素的X－Gal／IPTG的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取白色单菌落于含100 mg／L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组载体pMD18－T－TWH，将阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.6 RNAi表达载体的构建

在正向引物P1末端分别加接KpnⅠ和SpeⅠ酶切位点；在反向引物P2末端分别加接BamHⅠ和SacⅠ酶切位点，并加上保护碱基，重新合成两对引物P3与P4、P5与P6

（引物序列见表1）。以测序正确的重组载体pMD18－T－TWH为模板用引物P3与P4进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物回收后再克隆到pMD18－T载体中，将阳性克隆pMD18－T－TWH和pR1301载体分别用KpnⅠ和BamHⅠ进行双酶切，回收目的片段连接到pR1301载体上，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒后用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切验证。然后再以载体pMD18－T－TWH为模板用引物P5与P6进行PCR扩增，以同样的方法将第二链连接到已经正确插入第一链的中间载体上，再将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并酶切验证第二链的插入。两个片段用一个Waxy基因的内含子连接，形成反向重复的发卡结构，构建好表达载体pR1301－TWH，将表达载体pR1301－TWH用冰冻法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，然后将RNAi表达载体转化到水稻愈伤中，经一系列筛选分化得到转基因植株。

1.7 转基因植株的PCR检测

根据潮霉素基因序列设计特异引物P7与P8（引物序列见表1），以转基因植株DNA为模板进行PCR扩增，扩增目的片段大小为517 bp，PCR反应条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳检测。PCR扩增时以质粒pR1301－TWH、武育粳3号分别作为阳性和阴性对照。

2 结果与分析

2.1 RNAi表达载体构建

以水稻品种武育粳3号基因组总DNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增目的片段 （图2），将该片段回收后克隆到pMD18－T载体中。测序正确后以重组质粒pMD18－T－TWH为模板分别用引物P3与P4、P5与P6进行PCR扩增，PCR产物回收后再克隆到pMD18－T载体中，挑取阳性克隆提取质粒后用对应的性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ和SpeⅠ和SacⅠ分别进行双酶切（图3），酶切产物电泳后回收目的片段。然后将回收后的目的片段正向和反向插入载体pR1301的多克隆位点，转化后用双酶切验证 （图4），将构建好的RNAi表达载体pR1301－TWH导入根癌农杆菌EHA105感受态细胞用于水稻遗传转化。

图2 目的片段PCR扩增产物电泳图谱

图3 质粒pMD18－T－TWH的酶切鉴定图

图4 质粒pR1301－TWH的酶切鉴定图

2.2 水稻遗传转化及转基因植株的获得

以武育粳3号成熟胚诱导的愈伤组织作为转化受体，经根癌农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将表达载体pR1301－TWH导入水稻中。经潮霉素抗性筛选，选择生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化再生培养，最终获得40株T0代转基因植株。以转基因植株叶片总DNA为模板，用潮霉素基因特异引物P7与P8进行PCR检测（图5），共有34株检测到517 bp左右的目标片段，PCR阳性率为85%。

3 小结与讨论

图5 T0代转基因植株的PCR检测结果

1）虽然RNA干涉在作用机制等方面还不十分清楚，但作为一种新的技术方法，已经在各个不同的生物研究中被广泛应用。应用RNA干涉技术迅速地抑制目的基因的表达，能尽快了解到目的基因的功能。该研究将构建的表达载体pR1301－TWH导入水稻愈伤组织中，获得了阳性转基因植株，下一步计划将转基因苗移栽到海南试验基地，抽穗后进行表型鉴定和表达分析，研究TWH基因的功能。

2）载体设计是载体构建的关键。由于RNAi机制只对成熟的mRNA产生作用，因此用于设计RNA干涉载体的靶序列应处于基因的一个外显子内。Wesley 等［7］的研究表明 RNAi片段的长度在 98～853 nt之间都是可行的，不会对沉默效率产生明显影响；同时将间隔区内含子插入反向互补重复区可以增强其稳定性。因此，在本研究中我们选择TWH基因一个外显子部分的253 bp为靶序列构建RNAi载体，并在两个反向重复序列间加入一个Waxy基因的内含子作为间隔区，目的是为了提高转基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表达。

参考文献：

［1］FIRE A，XU S Q，MONTGOMERY M K，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806－811.

［2］CHEN J， TANG W H， HONG M M， et al.OsBP－73， a rice gene， encodes a novel DNA－binding protein with a SAP－like domain and its genetic interference by double－stranded RNA inhibits rice growth［J］.Plant Molecular Biology， 2003，52（3）：579－590.

［3］PRASAD K， VIJAYRAGHAVAN U.Double－stranded RNA interference of a rice PI／GLO paralog， OsMADS2， uncovers its second－whorl－specific function in floral organ patterning［J］.Genetics，2003，165（4）：2301－2305.

［4］XIAO H， WANG Y， LIU D， et al.Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 by RNA interference［J］.Plant Molecular Biology，2003，52（5）：957－966.

［5］LI J B， XIA M Y， WAN B L， et al.Genetic analysis and mapping of TWH gene in rice twisted hull mutant［J］.Rice Science，2009，16（1）：79－82.

［6］刘巧泉，张景六.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立［J］.植物生理学报，1998，24（3）：259－271.

［7］WESLEY S V， HELLIWELL C A， SMITH N A， et al.Construct design for efficient， effective and high－throughput gene silencing in plants［J］.The Plant Journal，2001，27（6）：581－590.