(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103525914 A(43)申请公布日 2014.01.22
(21)申请号 201310440028.2(22)申请日 2013.09.23
(71)申请人光明乳业股份有限公司
地址201103 上海市闵行区吴中路578号(72)发明人张红发 任婧
(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所 31283
代理人朱水平 沈利(51)Int.Cl.
C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/02(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/25(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图1页序列表2页 附图1页
(54)发明名称
一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒(57)摘要
本发明公开了一种计数植物乳杆菌ST-III活菌数的方法及其引物和试剂盒。该方法包括步骤：（1）以平板计数法计数样品中的活菌数X；（2）分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物以及检测
（3）根据步骤（2）细菌16S rRNA的通用引物对；
所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W，W=X×Z÷Y。本发明的方法操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便快速地检测样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数。CN 103525914 ACN 103525914 A
权 利 要 求 书
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1.一种对样品中植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III活菌进行计数的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）以平板计数法计数样品中的活菌数X；（2）分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物以及检测细菌16S rRNA的通用引物对；
（3）根据步骤（2）所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W，W=X×Z÷Y。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应的扩增程序为：①93～96℃，4～6min；②93～96℃，20～40s；③53～58℃，20～40s；④70～74℃，20～40s；⑤70～72℃，5～10min；其中，步骤②至④的循环数为25～35；所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2～0.4μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.15～0.35mmol/L dNTP、0.8～1.2×PCR buffer、0.8～1.8mM的Mg2+、0.015～0.025U/μL Taq DNA聚合酶和0.5～2ng/μL模板。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应的扩增程序为：①95℃，5min；②95℃，30s；③55℃，30s；④72℃，30s；⑤72℃，5min；其中，步骤②至④的循环数为30；所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.25μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1mM的Mg2+、0.02U/μL Taq DNA聚合酶和1ng/μL模板。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述阳性条带包括由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物扩增出的173bp的条带和由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的通用引物对扩增出的362bp的条带。
6.一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其特征在于，其包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物。
7.一种用于检测植物乳杆菌ST-III的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求6所述的检测植物乳杆菌ST-III的引物对。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任一种或多种。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。
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说 明 书
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一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种计数植物乳杆菌（lactobacillus
plantarum）ST-III活菌数的方法及其引物和试剂盒。
[0001]
背景技术
光明乳业股份有限公司筛选的专利菌株植物乳杆菌ST-III，具有降血脂、降胆固醇、减肥等益生功效，但是植物乳杆菌的种类很多，并不是所有植物乳杆菌都具有这些功能。而且益生菌要发挥益生功能，其活菌数必需大于106cfu/g，产品中植物乳杆菌ST-III的活菌数决定着产品的质量与功能。为此，有必要发展准确的特定菌株活菌计数技术。[0003] 到目前为止，已经有一些应用PCR检测鉴定植物乳杆菌ST-III的方法。如专利CN102453767A中公开了一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法及其试剂盒，该方法的基本操作包括：提取待检样品的总RNA，反转录成cDNA，再做荧光定量。由于菌体内的RNA分解速度较快，通常只有在菌体保持新鲜的状态下才能获得较准确的结果，因此该方法只适合于对新鲜的样品进行计数。当样品存放一段时间后，产品中的活菌数可能变化不大，但是提取的RNA却可能发生部分降解，从而影响计数的准确性。此外，该方法的检测极限仅为2.85x103cfu/mL，并在检测过程中常伴有正负1个数量级的误差，而且该方法的操作过程很繁杂，对实验者的要求很高，更由于所使用的部分试剂有毒，因此在实际应用中难以推广。又如，专利CN102533790A中公开了一种检测植物乳杆菌ST-III的PCR检测方法及其引物和试剂盒，该方法能特异性地检测植物乳杆菌ST-III，但却不能区分产品中的死菌与活菌，且在PCR反应中常出现假阴性和假阳性，所以该方法也无法对样品中的植物乳杆菌ST-III的活菌数进行准确的计数。因此，到目前为止，本领域尚缺乏系统的、能够准确定量检测植物乳杆菌ST-III活菌的计数方法。
[0002]
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对目前对植物乳杆菌ST-III的定量检测方法灵敏度不够高、准确性较差且操作复杂的缺陷，而提供一种新的计数植物乳杆菌ST-III活菌数的方法及其引物和试剂盒。本发明的方法及其引物和试剂盒用于测定植物乳杆菌ST-III，其操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便、快速地测定样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数，为具有特定功能的植物乳杆菌ST-III的应用打下基础；同时也为研究其它功能性菌株的活菌计数方法提供了有益参考。[0005] 本发明提供的技术方案之一是：一种对样品中植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III活菌进行计数的方法，其包括如下步骤：[0006] （1）以平板计数法计数样品中的活菌数X；
[0007] （2）分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因
组DNA为模板分别进行PCR反应，所述PCR反应的反应体系中加入SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物以及检测细菌16S rRNA的通用引物对；
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说 明 书
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[0008] （3）根据步骤（2）所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z，即得样
品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W，W=X×Z÷Y。[0009] 本发明步骤（1）中，所述的平板计数法为本领域常规所述，一般是先将待测样品进行梯度稀释，将稀释后的样品涂布计数平板，直至在计数平板上长出单克隆，对单克隆菌落进行计数即可。所述的计数平板可以为本领域常规，如MRS固体平板、TPY固体平板和BBL固体平板等。较佳地，在本发明中，所述平板计数法为采用MRS固体平板培养稀释后的样品，直至在MRS固体平板上长出单克隆，对单克隆菌落进行计数，所得菌落数代表样品中的活菌数X。
[0010] 本发明步骤（2）中所述分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA一般按常规分子生物学检测的方法进行，所述Y的数量可为任意的适合于常规实验操作进行的数目，一般在10～100之间为佳。[0011] 本发明步骤（2）中，所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为本领域常规所述，只要其能够扩增出细菌16S rRNA的对应片段即可，以此作为检测时的阳性对照，防止假阴性的发生。较佳地，所述的检测细菌16S rRNA的通用引物对为序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。[0012] 本发明步骤（2）中，所述PCR反应的扩增程序为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述PCR反应的扩增程序为：①90～98℃，3～10min；②90～98℃，10～120s；③45～60℃，10～120s；④65～80℃，20～120s；⑤68～75℃，2～30min；其中，步骤②至④的循环数为20～45。更佳地，所述PCR反应的扩增程序为：①93～96℃，4～6min；②93～96℃，20～40s；③53～58℃，20～40s；④70～74℃，20～40s；⑤70～72℃，5～10min；其中，步骤②至④的循环数为25～35。最佳地，所述PCR反应的扩增程序为：①95℃，5min；②95℃，30s；③55℃，30s；④72℃，30s；⑤72℃，5min；其中，步骤②至④的循环数为30。[0013] 本发明步骤（2）中，所述PCR反应的反应体系为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.1～0.5μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物和检测细菌16S rRNA的通用引物对、0.1～0.5mmol/L dNTP、0.5～1.5×PCR buffer、0.5～2mM的Mg2+、0.01～0.03U/μL Taq DNA聚合酶和0.1～10ng/μL模板。更佳地，所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2～0.4μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.15～0.35mmol/L dNTP、0.8～1.2×PCR buffer、0.8～1.8mM的Mg2+、0.015～0.025U/μL Taq DNA聚合酶和0.5～2ng/μL模板。最佳地，所述PCR反应的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.25μmol/L序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1mM的Mg2+、0.02U/μL Taq DNA聚合酶和1ng/μL模板。[0014] 本发明步骤（2）中，在分别提取步骤（1）所述平板上所长的Y个单菌落的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板分别进行PCR反应时，较佳地还包括同时以步骤（1）所述的计数平板的培养基成分为阴性对照的模板进行阴性对照PCR，所述阴性对照PCR的反应体系除模板为步骤（1）所述的计数平板的培养基成分之外，其余同步骤（2）所述的PCR反应，所述阴性对照PCR的反应程序同步骤（2）所述的PCR反应。
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本发明步骤（3）中，所述阳性条带包括由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物扩
增出的173bp的条带和由检测细菌16S rRNA的通用引物对扩增出的对应阳性片段；所述根据步骤（2）所得反应产物中阳性条带的存在与否统计阳性菌落数Z即指，若步骤（2）所得的反应产物中同时存在由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物扩增出的173bp的条带和由检测细菌16S rRNA的通用引物对扩增出的对应阳性片段，则说明该菌落为阳性菌落，若步骤（2）所得的反应产物中不同时存在由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物扩增出的173bp的条带和由检测细菌16S rRNA的通用引物对扩增出的对应阳性片段，则说明该菌落为阴性菌落。较佳地，所述阳性条带包括由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物扩增出的173bp的条带和由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的通用引物对扩增出的362bp的条带。[0016] 本发明提供的技术方案之二是：一种检测植物乳杆菌ST-III的引物对，其包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物。
[0017] 本发明所述的引物对与细菌16S rRNA的通用引物对一起使用进行多重PCR反应，可以更特异地检测植物乳杆菌ST-III菌株，保证结果的准确性。[0018] 本发明提供的技术方案之三是：一种用于检测植物乳杆菌ST-III的试剂盒，其包括如上所述的检测植物乳杆菌ST-III的引物对。[0019] 较佳地，所述的试剂盒中还包括检测细菌16S rRNA的通用引物对，所述引物对优选序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。[0020] 较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCR buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任一种或多种。[0021] 更佳地，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。[0022] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0023] 本发明所用试剂和原料均市售可得。[0024] 本发明的积极进步效果在于：本发明的方法操作简单，特异性强，灵敏度高，能够方便快速地检测样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数，达到平板计数的准确度，为具有特定功能的植物乳杆菌ST-III的应用打下基础；同时也为其它功能性菌株的计数方法提供了有益参考。附图说明
图1为PCR引物特异性验证的结果图，其中，M为DL2,000DNA Marker；0为阴性对
照；1为L.plantarum ST-III；2为L.plantarum ATCC8014；3为L.plantarum ACCC11095；4为L.plantarum GIM6003；5为L.plantarum LP-Onlly；6为L.plantarum WCFS1；7为Bifidobacterium animalis Bb-12；8为Bifidobacterium bifidum；9为Lactobacillus helveticus；10为Streptococcus thermophilus ST-21；11为Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus；12为Lactobacillus.acidophilus NCFM；13为Bacillus subtilis CMCC63501；14为Escherichia coli ATCC25922。[0026] 图2为实施例2多重PCR计数的结果图，其中，M为DL2,000DNA Marker；0为阴性对照；1-20分别代表选取的单个菌落1-20。
[0025]
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具体实施方式
[0027] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0028] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0029] 下述实施例中所用引物和探针由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。[0030] 实施例1多重PCR引物特异性验证
[0031] 选择与植物乳杆菌ST-III同种不同株以及不同种的细菌，抽提菌体DNA为模板进行多重PCR反应，检验多重PCR引物的特异性。所用菌株为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ST-III，光明乳业技术中心），其它同种不同株植物乳杆菌（L.plantarum ATCC8014、L.plantarum ACCC11095、L.plantarum GIM6003、L.plantarum LP-Onlly、L.plantarum WCFS1，均购自上海北诺生物科技有限公司）；不同种的细菌为：动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis Bb-12，购自科汉森有限公司）、两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum，购自丹尼斯克有限公司)、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus，购自丹尼斯克有限公司）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus ST-21，购自丹尼斯克有限公司）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus，购自丹尼斯克有限公司）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus.acidophilus NCFM，购自科汉森有限公司）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis CMCC63501，购自上海北诺生物科技有限公司）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922，购自上海北诺生物科技有限公司）。[0032] 在PCR反应体系中加入由序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物组成的通用引物对进行PCR，作为阳性对照以防止假阴性的发生。所述多重PCR反应的反应体系的总体积为30μL，其中包括0.25μmol/L序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1mM的Mg2+、0.02U/μL Taq DNA聚合酶和1ng/μL模板DNA，其余为去离子水。所述多重PCR反应的扩增程序为：95℃预热5min，30个循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s），72℃延伸5min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图1所示。[0033] 从图1可以看出，所有细菌的阳性标记PCR都有条带（362bp），说明PCR试剂有效。只有植物乳杆菌ST-III能特异性扩增出相应的菌株特异性条带（173bp），而其它细菌，特别是与植物乳杆菌ST-III相近的同种不同株的植物乳杆菌都没有扩增出相应的条带。实验结果说明本发明多重PCR的特异性强，可以适合于对混合发酵产品中植物乳杆菌ST-III的检测。
实施例2多重PCR对植物乳杆菌ST-III计数
[0035] 光明乳业有限公司生产的畅优酸奶含有功能性益生菌植物乳杆菌ST-III，另外还含有嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和动物双歧杆菌等。称取1g样品，做系列梯度稀释，选择10-5、10-6两个梯度，分别涂布MRS固体平板，厌氧箱内培养2-3天。选择菌落数在30-300间的平板进行计数，将稀释倍数与计数所得的平均菌落数相乘即得样品中植物乳杆菌ST-III的疑似菌落总数（该疑似菌落总数包含植物乳杆菌ST-III，同时还可能包含部分杂菌）。随
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机挑选一定数量的（本实施例选取了20个单菌落）植物乳杆菌ST-III疑似单菌落，做PCR鉴定。用灭菌枪头吸取菌体，吹吸数次将益生菌菌体悬浮于抽提试剂中，抽提试剂由终浓度为1×PCR缓冲液和0.02mol/L NaOH组成。100℃水浴5分钟，混合物直接作为PCR模板。同时在平板空白处吸取培养基用抽提试剂提取作为阴性空白对照。根据植物乳杆菌ST-III PCR鉴定为阳性所占的比例，以及平板计数的疑似菌落总数，计算出产品中植物乳杆菌ST-III的数量。
[0036] 结果如图2所示，所选取的20个菌落（Y）都有细菌阳性标志PCR条带，其中15个（Z）为植物乳杆菌ST-III，Z与Y的比值为15/20，平板计数结果（X）为2.1×108cfu/g。因此所检测的样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W为1.6×108cfu/g（由2.1×108cfu/g×15÷20计算得出）。阴性对照的2对PCR引物都没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。
[0037] 实施例3植物乳杆菌ST-III保藏计数
[0038] 将光明乳业有限公司生产的畅优酸奶在4℃保藏一个月，计数植物乳杆菌ST-III活菌数。具体操作参照实施例2。所述多重PCR反应的反应体系的总体积为30μL，其中包括0.2μmol/L序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.15mmol/L dNTP、0.8×PCR buffer、0.8mM的Mg2+、0.015U/μL Taq DNA聚合酶和0.5ng/μL模板DNA，其余为去离子水。所述多重PCR反应的扩增程序为：93℃预热4min，25个循环（93℃，20s；53℃，20s；70℃，20s），72℃延伸5min。[0039] 结果显示，所选取的20个菌落（Y）都有细菌阳性标志PCR条带，其中10个（Z）为植物乳杆菌ST-III，Z与Y的比值为10/20平板计数结果（X）为1.6×108cfu/g。因此，所检测的样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W为8×107cfu/g（由1.6×108cfu/g×10÷20计算得出），大于1×106cfu/g，说明产品在保质期内合格。阴性对照没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。同时，本实施例还抽提了待测样品的菌体RNA，发现在实验过程中菌体RNA完全降解，无法按照专利CN102453767A介绍的方法进行检测。[0040] 实施例4光明畅优植物乳酸菌饮品ST-III计数[0041] 称取1g光明畅优植物乳酸菌饮品样品，具体操作参照实施例2。所述多重PCR反应的反应体系的总体积为30μL，其中包括0.4μmol/L序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、0.35mmol/L dNTP、1.2×PCR buffer、1.8mM的Mg2+、0.025U/μL Taq DNA聚合酶和2ng/μL模板DNA，其余为去离子水。所述多重PCR反应的扩增程序为：96℃预热6min，35个循环（96℃，40s；58℃，40s；74℃，40s），70℃延伸10min。
[0042] 结果显示，所选取的20个菌落（Y）都有细菌阳性标志PCR条带，其中3个（Z）为植物乳杆菌ST-III，Z与Y的比值为3/20，平板计数结果（X）为1.7×108cfu/g。因此，所检测的样品中植物乳杆菌ST-III活菌数W为2.6×107cfu/g（由1.7×108cfu/g×3÷20计算得出）。阴性对照没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。[0043] 实施例5光明畅优植物乳酸菌饮品室温保藏计数[0044] 将光明畅优植物乳酸菌饮品在25℃保藏2周，计数产品中植物乳杆菌ST-III的活菌数。具体操作参照实施例2。所述多重PCR反应的体系为：序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物(5μmol/L)1μL，2.5m M dNTP2μL，
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10×PCR Buffer3μL，模板DNA1μL，Taq DNA聚合酶0.9U，加去离子水至总体积为30μL。所述多重PCR反应的扩增程序为：94℃预热4min，30个循环（94℃，20s；54℃，20s；72℃，20s），72℃延伸5min。[0045] 结果显示，所选取的20个菌落（Y）都有细菌阳性标志PCR条带，其中6个（Z）为植物乳杆菌ST-III，Z与Y的比值为6/20，平板计数结果（X）为1.6×102cfu/g。因此，所检测的样品中植物乳杆菌ST-III的活菌数W为4.8×101cfu/g（由1.6×102cfu/g×6÷20计算得出），远小于1×106cfu/g。阴性对照没有条带，说明PCR没有污染，计数准确。说明光明畅优植物乳酸菌饮品不适宜室温存放，易造成菌体失活。而专利CN102453767A中介绍的方法的检测极限仅为2.85x103cfu/mL，无法对活菌数低的样品进行检测。
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