胶原蛋白纤维制备及生物相容性研究

朱其圣 李瑞生

财团法人纺织产业综合研究所

摘要 ：高纯度胶原蛋白原液藉由氯化钠溶液进行湿式纺丝,得到胶原蛋白纤维,使胶原蛋白在原有的优良生物相容性及生物亲合性下,能够增加不同的应用.胶原蛋白纤维水洗槽中加入戊二醛(GA)等交联剂进行交联改质,可以改进胶原蛋白水溶性过好,及易潮解之性质. 本研究针对胶原蛋白纤维进行生物相容性实验,并进一步评估与市售品间之差异. 关键词:胶原蛋白纤维,交联剂,生物相容性

前言 ：胶原蛋白为生体组织固有之成分,具备有良好的生物相容性,生物可降解性

(biodegradabiblity),促进凝血及低免疫性等特性1-3,使其在生物医学上广泛地被使用在药物释放载体,止血材,敷伤材料,皮肤组织细胞之培养基质或皮肤替代物与骨组织重建等应用方面.本实验所纯化后之胶原蛋白经电泳分析为高纯度的等级,填充於针筒中,由挤压机挤入成形液中.成形液采用氯化钠之水溶液,卷取速度为24cm/sec,此条件所制成的纤维直径大约为

100~150μm.胶原蛋白纤维藉由添加交联剂进行改质,使胶原蛋白在原有的优良生物相容性及生物亲合性下,能够增加不同的应用. 临床上,利用植皮手术或是人工合成敷料,将开放性伤口转变为封闭性伤口,以减少水分蒸散及细菌入侵的机率4.为了减少烧烫伤等需经常换药照顾的伤口,使用创伤敷材可以减轻伤患痛苦5.因为合成敷材在临床上应用广泛,所以物美价廉之合成敷料产品不但有助於临床医疗品质之提升,亦可节省大量医疗费用.本实验探讨细胞与胶原蛋白纤维的相互作用,以提供进一步研发敷伤材之理论基础,以下将针对胶原蛋白纤维进行一系列生物相容性实验

一,实验设备及仪器

1. 0.5L小型湿式纺丝设备；2. 10L成型槽设备 ；3.高速均质机 ：4.电子显微镜 二,实验原料

胶原蛋白 实验室制备 ：氯化钠 台盐实业：戊二醛 景明化工 三,实验条件

(一)胶原蛋白萃取及纤维制备条件:

1.将牛皮刮除牛毛及表皮：2.利用碱性溶液溶除脂肪：3.利用胃蛋白酶去除免疫端；4.将溶液置换为醋酸缓冲液；5.进行梯度盐析,纯化胶原蛋白；6.将胶原蛋白原液加入给料桶；7.以挤出方式将胶原蛋白挤入氯化钠成型液中；8.将胶原蛋白纤维通过戊二醛之水洗槽；9.利用乙醇去除残留之戊二醛；

(二)胶原蛋白纤维生物相容性实验内容: 1.细胞几何型态实验观察

(1)将L929 mouse fibroblast培养於6cm的细胞培养盘中.

(2)当细胞生长达到confluence时,将已消毒过的待测材料置於培养盘的中央,再将细胞培养一天.

(3)培养一天后,利用光学显微镜观察待测材料附近细胞的几何形态 2.体外细胞毒性测试(toxicity test)

根据ASTM F813-83的规范进行植入物的细胞毒性测试,其测试方法的步骤简述如下: (1)将L929 mouse fibroblast培养於6cm的细胞培养盘中.

(2)当细胞生长达到confluence时,将已消毒过的待测材料置於培养盘的中央,再将细胞培养一天.

(3)培养一天后,利用2%的crystal violet做组织染色,观察染色的范围来判定细胞毒性. 3.纤维母细胞於纤维表面之培养

将sample裁成10mm直径圆形形状,以无菌PBS清洗数次后,於UV下灭菌2 3天.加入2 ml

纤维母细胞悬浮液(6x105 cells/ml)与微粒培养3小时俟细胞贴附於其上,之后以PBS清洗sample数次移除未吸附或吸附情形不佳之细胞.将sample置换至新培养皿中继续培养,每隔2天更换新培养液,并於培养第1,4,7,10天后取出sample,测定细胞活性 4.细胞活性测试 (MTT assay)

3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,简称MTT,为黄色水溶性固体,可被活细胞粒线体中之去氢(mitrchondrial succinate dehydrogenases)代谢还原产生紫色的沉淀物formazan.因仅有活细胞内才存在具活性之粒线体酵素,故可藉助测定

formazan产量的多寡来评估细胞之存活率.其步骤简述如下:将待测活性之细胞样本中的培养液吸除后,以PBS冲洗数次.加入1 mL含MTT之新鲜培养液(0.5 mg MTT/mL),并置於37℃之培养箱内反应三个小时.移除未反应含有MTT之培养液后,添加500 μL DMSO,使用vortex震荡至紫色formazan颗粒完成溶解为止.取200 μL溶有formazan 之DMSO於酵素免疫分析仪

(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)下,於波长570nm下测量其吸光值,参考波长为650 nm.

(三)结果与讨论

一,胶原蛋白的萃取及纯化 胶原蛋白之纯度鉴定:

本实验所纯化后之type I胶原蛋白,其分子结构为[α1(I)]2 [α2(I)].经SDS-PAGE电泳结果显示(图1),图下端两个条纹分别为含1029个胺基酸的α2(I)与含1056个胺基酸之α1(I).由於胶原蛋白分子彼此间会因为氢键的作用而交联在一起,如β11(I)即是两条α1(I)所组成.甚至多个α-chain交联形成分子量更大的分子,因此在电泳胶片上的移动速率便较缓慢,此即电泳胶片上端会有多个条纹堆叠的原因. 二,生物相容性实验

1.细胞几何型态实验观察:

图2是细胞在Millipore AP250 1000 filter周围的几何型态照片,因此我们把它当作Negative control,与图3市售品(KaltostatR),图4胶原蛋白纤维来进行比较.另外,我们也利用

Millipore AP250 1000 filter盖住会在medium漂浮的测试敷材,以确定在测试时,敷材完成与细胞接触,以及防止敷材的移位.黑色区域为置放的sample的位置,而纤维母细胞在正常的生理型态应为纺垂状的构形,图中黑色区域附近的细胞都呈现纺锤状的构形,因此所置放的sample并未影响周围细胞的生长.细胞在市售品KaltostatR (图3),胶原蛋白纤维(图4)周围的几何型态与Negative control(图2)所呈现的是相同情形,这显示各种测试敷料其细胞相容性相当好. 2.细胞毒性测试(toxicity test):

图5-7所示,黑色区域为置放的sample的位置,整个培养皿经crtstal volent染色后,活的细胞生长的区域会呈现紫色,而透明区域则为死细胞的区域.sample周围会有一小圈透明区域,经仔细观察后,推论是在染色前,取下sample时,sample磨擦到附近的区域.整体来说,测试的sample都有紧邻著染色的区域,其细胞并未受的sample而造成lysis现象,因此推论所有测试的sample并无细胞毒性.

3.纤维母细胞於纤维表面之培养

将sample与L929纤维母细胞共同培养1天,然后利用SEM观察细胞在sample上贴附的型态,图8,9为Kaltostat与Seasorb商品,可明显观察到,并无细胞吸附於fiber表面上.图10为胶原蛋白纤维的sample表面,其表面则可观察的许多的细胞吸附於fiber表面上. 4.L929纤维母细胞之细胞活性测试

本实验采取6个小时为细胞贴附时间,此时间点评估材料与细胞间的相互关系,而48与72小时则为观察细胞在non-woven增生的情况.图11所示,在六个小时的时间点,胶原蛋白比例较高的non- woven,所吸附的细胞所表现的细胞活性较高,而Kaltostat商品几乎没有细胞活性的表现.

在培养48小时后,原先拥有较高细胞活性的a1c2与a1c4 之non-woven,则有明显下降的趋势,而与其他non- woven的细胞活性有少许的增加,而Kaltostat商品仍然没有细胞活性的表现.在培养72小时后,所有non-woven的细胞活性,几乎无明显差异,推论此时因该是细胞在

non-woven生长的饱和期,所表现的细胞活性也是相当,而Kaltostat商品仍然没有细胞活性的表现. 结论

本实验所纯化后之胶原蛋白经电泳分析为高纯度的等级,其浓度为8.4mg/ml.将所纯化之胶原蛋白填充於针筒中,挤入成形液.成形液采用氯化钠之水溶液,水洗液采用戊二醛水溶液,卷取速度为24cm/sec,此条件所制成的胶原蛋白纤维直径大约为100~150μm.细胞几何型态实验中,细胞都呈现纺垂状的构形,因此所置放的sample并未影响周围细胞的生长.在细胞毒性测试中,所有测试的sample都未产生细胞lysis现象,其sample周围的细胞都维持正常的生长型态.另

外,sample与细胞共同培养1天后,两种商品的sample,其表面都未有细胞贴附,而胶原蛋白纤维的sample中,明显可看到细胞贴附於纤维表面上.在利用MTT assay量测sample对细胞活性的影响,在胶原蛋白含量较多的sample中,在短时间的细胞活性较高,可能所吸附的细胞数量较多,而随培养时间的增加,其各种sample之细胞活性的差异性也明显缩小,到达3day的培养时间后,其各种sample之细胞活性并无明显的差异.值得注意的是,Kaltostat商品并无细胞活化表现,推论是无细胞贴附於此sample的表面上.整体来说,所增加的胶原蛋白,有明显增加细胞吸附的数量,有助於未来细胞在此纤维表面的增生. 参考文献

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