快速一步法提取组织DNA的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112575061 A(43)申请公布日 2021.03.30

(21)申请号 202011570847.5(22)申请日 2020.12.26

(71)申请人 苏州大学

地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路8

号(72)发明人 夏水秀　方坛芬　丁威　韩蓉　

薛满　孙万平　(74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有

限公司 32103

代理人 孙周强　陶海锋(51)Int.Cl.

C12Q 1/6806(2018.01)

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页

CN 112575061 A(54)发明名称

快速一步法提取组织DNA的方法(57)摘要

本发明属于核酸提取技术领域，具体为一种快速一步法提取组织DNA的方法，将组织加入快速一步法核酸提取试剂中，静置，完成组织DNA的提取；所述快速一步法核酸提取试剂包括下述原料：氢氧化钠（NaOH）、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、醋酸钾（KAc）。采用本发明的提取方法，组织只需与试剂静置2~6min，无须多步反应和实验设备，所提取的组织DNA浓度与纯度均较好；静置2‑6分重点的5个不同时间点的上清，稀释10倍作为PCR扩增模板时，扩增产物电泳条带均较清晰。因此，本发明方法对组织进行现场核酸的即时检验（point‑of‑care testing，POCT）具有极其重要的意义。

CN 112575061 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.一种快速一步法提取组织DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤，将组织加入快速一步法核酸提取试剂中，静置，完成组织DNA 的提取；所述快速一步法核酸提取试剂包括氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾。

2.根据权利要求1所述快速一步法提取组织DNA的方法，其特征在于，将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成快速一步法核酸提取试剂。

3.根据权利要求2所述快速一步法提取组织DNA的方法，其特征在于，氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L；乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L；醋酸钾的浓度为3 mol/L。

4.根据权利要求1所述快速一步法提取组织DNA的方法，其特征在于，静置后取上清，得到组织的DNA，完成组织DNA的提取。

5.根据权利要求1所述快速一步法提取组织DNA的方法，其特征在于，静置的时间为1～6min。

6.根据权利要求5所述快速一步法提取组织DNA的方法，其特征在于，静置的时间为2～5min。

7.一种组织DNA扩增的方法，其特征在于，包括以下步骤，将组织加入快速一步法核酸提取试剂中，静置，取上清液；以上清液为模板进行PCR反应，完成组织DNA的扩增。

8.根据权利要求7所述组织DNA扩增的方法，其特征在于，所述组织为猪肝。9.根据权利要求7所述组织DNA扩增的方法，其特征在于，将上清液稀释后为模板进行PCR反应，完成组织DNA的扩增。

10.根据权利要求7所述组织DNA扩增的方法，其特征在于，将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成快速一步法核酸提取试剂。

2

CN 112575061 A

说　明　书

快速一步法提取组织DNA的方法

1/5页

技术领域

[0001]本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及快速一步法提取组织DNA的方法。背景技术

[0002]提取组织基因组DNA的方法有多种，其中经典的方法有酚抽提法、甲酰胺裂解法、异丙醇沉淀法、盐酸胍裂解玻璃棒缠绕法及酚‑氯仿法等（参见萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯著 T．分子克隆实验指南第2版，科学出版社，1992：463‑469.），这些方法都能获得高质量DNA，但是提取过程繁琐，技术、设备要求高、耗时长。在经典的DNA提取方法上经过改进、优化出现了盐析法、试剂盒提取法、颗粒吸附法，但仍需要特殊设备（如高速冷冻离心机）并以高成本为代价。因此，配制一种DNA快速提取液是实现POCT的第一步。目前市场上的一些快速一步提取液虽然缩短了提取时间，但是仍存在所提DNA纯度较差，可能会对后续扩增反应造成影响；需要高温加热的步骤，不适用于POCT等问题。因此，现场快速DNA 提取是建立核酸现场检测（POCT）方法的前提。发明内容

[0003]本研究主要开发一种快速一步提取液对组织DNA进行快速提取, 并通过提取时间与上样浓度给出组织DNA提取方法，同时与2种商用试剂盒与2种商用一步法提取液进行对比，证实本发明的提取方法效果较好且所需时间短，满足POCT的要求。[0004]本发明采用如下技术方案：

一种快速一步法提取组织DNA的方法，包括以下步骤，将组织加入快速一步法核酸

提取试剂中，静置，完成组织DNA 的提取。[0005]一种组织DNA扩增的方法，包括以下步骤，将组织加入快速一步法核酸提取试剂中，静置，取上清液；以上清液稀释液为模板进行PCR反应，完成组织DNA的扩增。[0006]本发明的快速一步法核酸提取试剂由氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾、水组成；其中氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L，醋酸钾的浓度为3 mol/L；将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成快速一步法核酸提取试剂。

[0007]本发明中，静置的时间为1～6min，优选为2～5分钟，更有选为2分钟。本发明方法能够达到简单快速的标准，使用本发明DNA一步提取液进行组织DNA提取时，整个提取过程不到5 min。

[0008]本发明中，将上清液稀释后为模板进行PCR反应，完成组织DNA的扩增；优选的，稀释的倍数为10倍。取上清液以及稀释上清液的方法都为常规技术，后续的PCR反应以及电泳测试也是常规方法。

[0009]本发明的创造性在于提供新的提取方法，可以在5分钟内完成组织DNA的提取，经过稀释后，作为模板进行扩增，具有扩增结果清晰、提取液浓度高、纯度好的优点。

3

CN 112575061 A

说　明　书

2/5页

附图说明

[0010]图1为DNA模板进行PCR扩增后的电泳照片，注：泳道1~6分别为静置1、2、3、4、5、6min(原液为模板)；泳道7~12分别为静置1、2、3、4、5、6min(稀释10倍为模板)；13为阳性对照（TIANGEN提取DNA原液）；14为阴性对照。具体实施方式

[0011]本发明将组织加入快速一步法核酸提取试剂中，静置，常规取上清即可完成组织DNA 的提取，无需其他步骤；得到的上清稀释后作为扩增模板进行DNA扩增。[0012]实验材料

主要仪器

主要试剂耗材

4

CN 112575061 A

说　明　书

3/5页

实施例一 DNA提取

快速一步法核酸提取试剂，由氢氧化钠（NaOH）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、醋

酸钾（KAc）、水组成，将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，常规混合，组成快速一步法核酸提取试剂，即一步法DNA提取试剂；其中氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L，醋酸钾的浓度为3 mol/L。[0013]称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，加入上述一步法DNA提取试剂200μL，静置2min后常规吸取上清；将上清液用水稀释10倍作为PCR扩增模板，整个过程不到5分钟。[0014]对比例一

将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠加入水中，组成一步法DNA提取试剂，其中氢氧化

钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L。称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，加入上述提取试剂200μL，静置2min后常规吸取上清。[0015]对比例二

将氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸钾加入水中，组成一步法DNA提取试剂，其中

氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为10 mmol/L，醋酸钾的浓度为5 mol/L。称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，加入上述提取试剂200μL，静置2min后常规吸取上清。

[0016]称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，另外分别按照所购买的两种试剂盒以及两种一步法快提试剂的提取步骤进行DNA提取，得到上清液。[0017]浓度与纯度测定

将上述7种方法所提的猪肝DNA用Nanodrop2000c核酸蛋白仪检测，获得DNA浓度和

具体数据见表1。A260 nm/A280 nm比值。

[0018]

由表1可以看出，本发明的提取液与TIANGEN组织基因组提取试剂盒的提取浓度与

纯度(A260/A280)均较好，但是TIANGEN组织基因组提取试剂盒所需时间较长，需2 h左右，不适用于快速的POCT，而本发明的提取液在5 min内即可完成DNA提取。在测试成本方面，本

5

CN 112575061 A

说　明　书

4/5页

发明的提取液成本远低于试剂盒。在辅助设备方面，本发明无需辅助设备，室温静置2min即可取上清，而TIANGEN组织基因组提取试剂盒的操作过程需要加热、高速离心等步骤；柱式动物线粒体DNAout，PCR级（北京天恩泽）的提取纯度好，但是浓度较低；两种商品化的通用一步DNA提取液提取浓度较高，但是这两种方法都需要高温加热且时间长，不如本发明提取方法室温下进行，适用于POCT。对比例一和二结果显示，本发明的自配一步提取液在提取浓度和纯度上均有显著提高。[0019]实施例二

称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，加入实施例一的一步法DNA提取试剂200μL，

静置后取上清；从加入提取试剂开始计时，分别取静置1、2、3、4、5、6min后的样品上清并置于新的1.5ml离心管中；将上清稀释10 倍与未稀释的上清分别作为DNA模板进行PCR扩增、电泳。实验结果见图1。

[0020]称取猪肝样品20mg,剪成芝麻粒大小，采用现有试剂盒提取DNA，作为DNA模板进行

实验结果见图1。上述同样的PCR扩增、电泳。

[0021]PCR反应体系配制：

PCR反应程序：

6

CN 112575061 A

说　明　书

5/5页

琼脂糖凝胶电泳检测琼脂板放入电泳池，贴紧边缘，样品依次进样4.5µL，mark(100bp)进样1.5µL。电泳

程序：U=140V I=200mA time=30min。[0022]凝胶成像

将琼脂板置于凝胶成像仪，进行电泳跑样的部分处于正中央→启动凝胶成像系统

→开启300nm光源，调整对焦，变焦，光圈，使图像清晰→扫描图像→关闭光源，保存图片，取出琼脂板。

[0023]图1结果显示，使用实施例一一步法DNA提取试剂提取时，未稀释模板无法有效扩增，稀释10倍作为模板时，静置2~6min的5个不同时间所提DNA的扩增产物电泳条带均清晰，与13泳道条带相当，而静置1min时电泳条带较暗。对比结果，选择自配一步提取液静置2 ~

上清稀释10倍后作为PCR扩增模板。5min，

[0024]本研究以猪肝为实验材料，选择本发明提取液配合提取方法，与商品化试剂盒以及市场上的通用一步法提取试剂进行DNA提取质量的比较，实验结果显示，使用本发明的提取方法整个提取过程只需不到5 min，提得的DNA能够满足PCR扩增的要求，该方法达到了简单、快速和现场提取的标准。

7

CN 112575061 A

序　列　表

1/1页

序列表<110> 苏州大学<120> 快速一步法提取组织DNA的方法<160> 2<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1

 20actactcata cccagcaagc

<210> 2<211> 22<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2taaggtgaca ataggtagtc ct 22

8

CN 112575061 A

说　明　书　附　图

1/1页

图1

9