高效液相色谱常见问题分析与对策

高效液相色谱常见问题分析与对策

液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。 A、峰拖尾 原 因 解决方法

1、筛板阻塞

a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱 2、色谱柱塌陷 填充色谱柱 3、干扰峰

a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱 4、流动相PH选择错误

调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰 5、样品与填料表面的溶化点发生反应

a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱 B、峰前延 原 因 解决方法 1、柱温低 升高柱温

2、样品溶剂选择不恰当 使用流动相作为样品溶剂 3、样品过载 降低样品含量 4、色谱柱损坏 见A1、A2 C、峰分叉 原 因 解决方法

1、保护柱或分析柱污染

取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。 2、样品溶剂不溶于流动相

改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。 D、峰变形 原 因 解决方法

1、样品过载 减少样品载量 E、早出的峰变形

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原 因 解决方法

1、样品溶剂选择不恰当

a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂 F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 原 因 解决方法

1、柱外效应

a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路） b、使用小体积的流通池 G、K’增加时，脱尾更严重 原 因 解决方法

1、二级保留效应，反相模式

a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d、更换一支柱子 2、二级保留效应，正相模式

a、加入三乙胺（或碱性样品） b、加入乙酸（或酸性样品） c、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法 3、二级保留效应，离子对 加入三乙胺（或碱性样品） H、酸性或碱性化合物的峰拖尾 原 因 解决方法

1、缓冲不合适

a、使用浓度50-100mM的缓冲液 b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液 I、额外的峰 原 因 解决方法

1、样品中有其他组份 正常

2、前一次进样的洗脱峰

a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速 3、空位或鬼峰

a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积 J、保留时间波动 原 因 解决方法 1、温控不当 调好柱温

2、流动相组分变化

防止变化（蒸发、反应等） 3、色谱柱没有平衡

在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

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K、保留时间不断变化 原 因 解决方法

1、流速变化 重新设定流速 2、泵中有气泡 从泵中除去气泡

3、流动相选择不恰当

a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相 L、基线漂移 原 因 解决方法

1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。） 控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图 2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。） 使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。 3、流通池被污染或有气体

用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸） 4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线） 取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。 5、流动相配比不当或流速变化

更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。 6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时

用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。

使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。 9、使用循环溶剂，但检测器未调整。

重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。 10、检测器没有设定在最大吸收波长处。 将波长调整至最大吸收波长处 M、基线噪音（规则的） 原 因 解决方法

1、在流动相、检测器或泵中有空气

流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。 2、漏液

见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。 3、流动相混合不完全

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用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂 4、温度影响（柱温过高，检测器未加热） 减少差异或加上热交换器

5、在同一条线上有其他电子设备

断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。 6、泵振动

在系统中加入脉冲阻尼器 N、基线噪音（不规则的） 原 因 解决方法 1、漏液

见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。

2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成 检查流动相的组成。 3、流动相各溶剂不相溶 选择互溶的流动相

4、检测器/记录仪电子元件的问题

断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。 5、系统内有气泡

用强极性溶液清洗系统 6、检测器内有气泡

清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器 7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。） 用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 8、检测器灯能量不足 更换灯

9、色谱柱填料流失或阻塞 更换色谱柱

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常

维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置 O、宽峰 原 因 解决方法

1、流动相组成变化 重新制备新的流动相 2、流动相流速太低 调节流速

3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）

见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。

4、检测器设定不正确 调整设定

5、柱外效应影响

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a、 柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长 5、 a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品b、 减少响应时间或使用更小的流通池c、 使用内径为0.007-0.01的短管路d、 减少响应时间 6、缓冲液浓度太低 增加浓度

7、保护柱污染或失效 更换保护柱

8、色谱柱污染或失效，塔板数较低

更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。 9、柱入口塌陷

打开柱入口，填补塌陷或更换柱子

10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰 选择其它类型的色谱柱以改善分离效果 11、柱温过低

提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃ 12、检测器时间常数太大 使用较小的时间常数 P、分离度降低 原 因 解决方法

1、流动相污染或变质（引起保留时间变化） 重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞图

去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。 Q、所有的峰面积都太小 原 因 解决方法

1、检测器衰减设定过高 减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大 设定较小的时间常数 3、进样量太少 增大进样量

4、记录仪连接不当 使用正确的连接

R、所有的峰面积都太大 原 因 解决方法

1、检测器衰减设定过低 采取较大的衰减 2、进样过多

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减少进样量

3、记录仪连接不正确 正确连接记录仪

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