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一株产蛋白酶嗜碱菌株的分离_鉴定及酶学特性

来源：帮我找美食网

ResearchPaper　　研究报告

微生物学报ActaMicrobiologicaSinica50(1):54-59;4January2010ISSN0001-6209;CN11-1995/Qhttp://journals.im.ac.cn/actamicrocn

一株产蛋白酶嗜碱菌株的分离、鉴定及酶学特性

郝建国

1,2

,薛燕芬,马延和

113

(1中国科学院微生物研究所,北京100101)(2中国科学院研究生院,北京100049)

摘要:【目的】筛选产蛋白酶嗜碱菌并对其进行鉴定和特性分析。【方法】利用碱性脱脂牛奶培养基分离纯化产蛋白酶嗜碱菌,通过形态特征、生理生化、16SrRNA基因序列分析以及DNA2DNA杂交实验确定菌株的分类地位,利用酪蛋白水解法分析所产蛋白酶的pH和温度作用范围、稳定性和耐氧化剂能力。【结果】从我国西藏盐碱湖样品中分离到一株产碱性蛋白酶的菌株ZL223,该菌株为革兰氏阳性菌,最适生长温度为37℃,最适生长pH910,16SrRNA基因序列分析显示,菌株ZL223与假强芽孢杆菌BacilluspseudofirmusOF4亲缘关系最近,16SrRNA基因序列相似性为9816%,DNA2DNA杂交结果显示与B.pseudofirmusOF4同源性为86%。菌株ZL223产生的蛋白酶作用的最适pH为1210,最适温度为40℃。【结论】结合生理生化指标测定的结果,鉴定菌株为假强芽孢杆菌ZL223(B.pseudofirmusZL223)。该菌株产生的碱性蛋白酶具有较高的pH适应性,值得进一步研究。关键词:嗜碱微生物;假强芽孢杆菌;16SrRNA基因;DNA2DNA杂交中图分类号:Q936　　文献标识码:A　　文章编号:000126209(2010)0120054206　　嗜碱微生物(alkaliphiles)是指那些最适生长在pH810以上,通常在pH910-1010之间的一类嗜

[1]

极微生物。嗜碱微生物具有重要的工业应用价值,它们产生的胞外酶多为碱性酶,在洗涤剂、制革、纺织、医药、化妆品等的生产中有广泛的应用价[2]

值。研究嗜碱微生物及利用碱性酶资源是一个重要的研究课题。嗜碱微生物广泛地存在于天然碱湖、碱性沙漠等极端自然环镜,以及水泥制造、印染以及造纸等人类生活和生产活动引起的人工碱

[3]

性环境。我国西藏拥有丰富的盐碱湖资源,由于其特殊的地理环境,其中丰富的嗜碱微生物资源还没有得到充分的开发利用。本研究从我国西藏班戈湖沉积样品中分离出一株产碱性蛋白酶的嗜碱

细菌,对其进行了多项分类学分析和蛋白酶的酶学性质分析,显示该菌株所产蛋白酶不同于已报道的碱性蛋白酶,为蛋白酶的工业应用提供了新资源。

1　材料和方法

111　材料

11111　样品来源:样品采自于我国西藏班戈盐碱

湖,主要由湖水和湖底沉积物组成,运抵实验室后于4℃密闭保存。

11112　培养基:富集培养基(FJ):脱脂奶粉(Skimmilk)10g/L,酵母粉5g/L,K2HPO41g/L,MgCl2012g/L,NaCl50g/L,Na2CO310g/L;分离培养培养

基采用HorikoshiⅠ培养基

[1]

,NaCl量改为50g/L。

(2007AA021306,2006AA020202)基金项目:国家“863计划”

通信作者。Tel:+86210264807590;Fax:+86210264807616;E2mail:mayanhe@im.ac.cn

作者简介:郝建国(1982-),男,天津人,硕士研究生,主要从事嗜碱微生物研究。E2mail:haojg@im.ac.cn收稿日期:2009205227;修回日期:2009206215

郝建国等:一株产蛋白酶嗜碱菌株的分离、鉴定及酶学特性./微生物学报(2010)50(1)55

以上培养基于115℃蒸汽灭菌20min。另外,FJ培养基中的脱脂奶粉和两种培养基中的Na2CO3分别灭菌后加入,培养基pH均为1010。如配制固体培养基时加入15g/L琼脂粉。

11113　主要试剂和仪器:脱脂奶粉(skimmilk)购

BLAST程序与GenBank中的16SrRNA基因序列进

行同源性比较,用MEGA410软件包中的Kimura

22parameter法计算遗传距离,用Neighbor2Joining法构建系统发育树,重复抽样1000次分析系统树各分枝的置信度。

116　DNA的G+Cmol%含量测定及DNA2DNA

[8]

自美国BD公司;聚合蛋白胨(polypeptone)购自日本制药株式会社;API50CH试剂盒购自法国生物梅里埃公司;ProteinAssay试剂盒购自美国Bio2Rad公司。Axioskop40相差显微镜购自德国ZEISS公司;DU800紫外分光光度计购自美国BeckmanCoulter

杂交分析

　　基因组DNA的提取参照Marmur所述方法进行,G+Cmol%含量测定采用热变性温度法(Tm值

[10]

法),DNA样品溶解在011×SSC缓冲液中,温度变化率为1℃/min,得到熔解温度Tm,按照经验公式(1)计算得出G+Cmol%含量。参照菌株为EscherichiacoliK12。

G+Cmol%=G+Cmol%参比菌株+

(1)2108×(Tm未知菌株-Tm参比菌株)　　参照文献方法对ZL223菌株和参比菌株进

行DNA杂交分析,测定紫外吸光值减少速率,依据公式(2)得到杂交百分数(其中V为吸光值减少速率,a为待测菌株ZL223,b为参比菌,m为二者DNA等量混合后所得样品)。杂交百分数D%=

4Vm-(Va+Vb)2

Va×Vb

[11]

[9]

公司;PCR仪购自德国Eppendorf公司。112　样品富集培养及菌株分离

将沉积物样品与湖水样品充分混匀,取50mL加入等体积的FJ培养基中,37℃震荡培养48h,取富集培养物在HorikoshiⅠ固体培养基上进行稀释涂布,获得能够降解脱脂奶粉形成透明圈的单菌落,在HorikoshiⅠ固体培养基上纯化,得到菌株ZL223。113　形态特征

KOH法确定菌株的革兰氏反应114　生理生化特性11411　生长特性:在5℃-55℃范围内测定菌株ZL223在各个温度下的生长量;在最适生长温度下,

[5]

;相差显微镜下观察菌体形态、大小、运动及产芽孢情况。

×100%(2)

117　发酵液蛋白酶性质分析

测定ZL223菌株在不同pH缓冲液(pH710-1210)中的生长量;在最适生长温度和pH条件下,测定不同NaCl浓度下ZL223菌株的生长量。以上均为1%的接种量,培养时间为2d,菌株的生长量以

OD600表征。

11412　碳源利用:使用梅里埃公司的API50CH试

蛋白浓度使用Bio2RadProteinAssay试剂盒测

定,以牛血清白蛋白为标准。蛋白酶活力测定参照

[12]

文献方法,以酪蛋白为底物在pH1210和40℃条件下测定。蛋白酶活力定义为:在最适条件下1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个活性单位(U),比活力为每mg酶蛋白所具有的活力(U/mg)。

将菌株ZL223以5%的接种量接入作为产酶培养基的FJ培养基,37℃振荡培养2d,离心获得上清液,以此作为粗酶液进行性质测定。将酶液于20℃-80℃温度下反应30min,测定出酶的温度作用范围;将酶加入到pH710-1010的一系列体系中进行酶反应,测定酶的pH作用范围;将酶于50℃、60℃和70℃保温一定时间,再测定酶活,得到了酶的热稳定性曲线;将酶液pH调节到pH810、pH1010和pH1210,处理一定时间,再测定酶活,得到酶的pH稳定性;在酶液中添加终浓度为3%的H2O2,保温一定时间后测定酶活,得到酶的耐氧化剂曲线;在酶反应体系中加入终浓度5mmol/L的各种金属离子和EDTA、EGTA以及SDS,以测定的活力表征金属离子等对酶的影响。

剂盒测定菌株对不同碳水化合物的利用。使用无菌的1mol/LNaOH调节培养基pH至910。11413　生化指标:参照文献方法

[1]

测定了ZL223

菌株的接触酶、氧化酶、淀粉酶、明胶水解以及硝酸盐和亚硝酸盐还原性质,所用培养基用无菌的1mol/LNaOH调节pH至910。115　16SrRNA基因序列分析

使用通用细菌引物27F(5′2AGAGTTTGAT

)和1541R(5′CATGGCTCAG23′2AAGGAGGTGA)对16SrRNA基因进行PCR扩TCCAGCCGCA23′

[7]

增。扩增条件是:95℃3min;95℃45s,55℃45s,72℃90s,30个循环;72℃10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后,送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。所得序列通过

56JianguoHaoetal./ActaMicrobiologicaSinica(2010)50(1)

2　结果

211　菌株分离及形态学特征

212　生理生化特征

通过利用含有脱脂奶粉的碱性培养基进行富集培养和平板划线纯化,获得产蛋白酶纯培养菌株

ZL223。菌株ZL223为短杆状,形成内生芽孢(图1),大小310μm-510μm×018μm-110μm,以周生鞭毛运动,革兰氏阳性。菌落呈圆形,浅黄色,表面平坦,光滑,较粘稠,易挑起,边缘整齐。

菌株ZL223兼性厌氧生长,在pH710-1010的条件下生长,最适生长pH为910;最高能够耐受15%NaCl,在含有5%NaCl条件下生长量最高;生长的温度范围是15℃-45℃,最适生长温度是35℃-40℃。能够分解酪蛋白、明胶、Tween40,对Tween60有微弱的分解能力,不能分解淀粉、Tween20和Tween80;触酶阳性,氧化酶阴性,不能还原硝酸盐。该菌能够利用D2木糖、葡萄糖、果糖、七叶灵、水杨苷、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、糖原、22酮基葡萄糖酸钾和土伦糖,并发酵产酸;不能利用阿拉伯糖、L2木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、乳糖和纤维二糖等。213　16SrRNA基因序列及系统发育学分析

测序得到菌株ZL223的16SrRNA基因序列,含有1456bp,其GenBank登录号为GQ202203。将菌株ZL223的16SrRNA基因序列与GenBank中的序列进行比对,发现与Bacillus属成员具有较高的序列相似性,用Neighbor2Joining方法构建的系统发育树(图2)表明与B.pseudofirmus种亲缘关系密

图1　菌株ZL223细胞形态(1000×)

Fig.1　PhasecontrastmicrographofstrainZL223showingthecellmorphologyandspore2forming,Bar,5μm.切,序列相似性达到了9714%-9816%。其中菌株ZL223与B.pseudofirmusOF4菌16SrRNA基因序列相似性最高,为9816%。

图2　基于16SrRNA基因序列构建的菌株ZL223与相关菌种的系统发育树,序列的Genbank登录号列于括号中,分支的置

信度百分数标注在分支节点(只列出大于95%的结果),标尺所示长度为015%核苷酸置换率

Fig.2　Neighbor2joiningphylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesshowingtherelationshipsbetweenstrainZL223andrelatedspecies1Accessionnumbersareshowninparentheses1Thenumberateachbranchpointrepresentthebootstrappercentages(valuesabove95%areshown)1Bar,

01005substitutionspernucleotideposition1

郝建国等:一株产蛋白酶嗜碱菌株的分离、鉴定及酶学特性./微生物学报(2010)50(1)57

214　DNA的G+Cmol%含量及DNA2DNA杂交215　碱性蛋白酶性质

分析　　通过测定菌株ZL223以及参比菌B.pseudofirmusOF4和E1coliK12的温度熔解曲线,得到了ZL223菌DNA的Tm为6916℃,通过公式计算出ZL223菌的G+Cmol%为4014%,这符合B.pseudofirmus种的G+Cmol%范围(3910%-4018%)。DNA2DNA杂交

粗酶液的酶学性质实验结果显示ZL223菌产

生的蛋白酶,pH作用范围为pH715-1215,最适反应pH为1210;温度作用范围是30℃-60℃,最适反应温度为40℃;在60℃保温50min,保持50%以上的活力;可以耐受pH810-1210处理4h并保持50%以上活力;能够耐受终浓度3%的H2O2,处理60min仍能保持50%以上的活力。Hg、SDS对酶

实验显示,ZL223菌与参比菌B.pseudofirmusOF4的

DNA2DNA杂交率为86%,显著高于70%的阈值,说明它们是同一物种的不同菌株

[13]

。

活力有抑制作用,Mg、Fe、Fe等对酶有一定的

激活作用(图3)。

2+2+3+

图3　各种因素对ZL223菌蛋白酶活性的影响

Fig.3　EffectofsomefactorsontheactivityandstabilityofproteasefromstrainZL2231(A),Temperatureprofile;(B),pHprofile;(C),Thermalstability;(D),pHstability;(E),H2O2resistance;(F),Metalion,EGTA,EDTA&SDStolerance.

3　讨论

　　假强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)是Nielsen

[14]

等于1995年基于16SrRNA基因的系统发育分析和其它特性建立的一个嗜碱芽孢杆菌新种,已有不同的研究者从不同的环境样品中分离获得,其中3个菌株的特征被描述:B.pseudofirmusDSM8715[15][16]

、B.pseudofirmusOF4和B.pseudofirmus[17]

FTU,显示出是B.pseudofirmus种的不同菌株。本文分离的嗜碱菌株ZL223来自我国西藏班戈盐碱湖,系统发育分析显示菌株ZL223与B.pseudofirmus的亲缘关系最近;DNA2DNA杂交是确定种的基本方法,一般认为同源性大于70%应为相

[13]

同的种,菌株ZL223与关系最近的B.

pseudofirmusOF4杂交同源性为86%,说明它们应当

属于同一个种;而且菌株ZL223具有与B.

pseudofirmus相同的一系列表型特征,例如革兰氏染色阳性、杆状、有芽孢、嗜碱、能利用碳水化合物产酸、基因组DNA的(G+C)mol%是4015%,这些基因型和表型特征表明这个新的分离菌是B.pseudofirmus种中的不同成员(表1)。但是菌株ZL223与B.pseudofirmus种已描述的其它成员的16SrRNA基因序列相似性仅为9816%,并且在一些表形特征方面也存在有明显的差异:B.pseudofirmusFTU在没有NaCl时不能生长和形成膨胀的芽孢等特性不同于菌株ZL223,B.pseudofirmusOF4形成膨胀的芽孢和利用麦芽三糖的特性不同于菌株ZL223,B.pseudofirmusDSM8715不能在pH710下生长以及能

58JianguoHaoetal./ActaMicrobiologicaSinica(2010)50(1)

利用淀粉和22酮基葡萄糖酸钾的特性不同于菌株

ZL223。综上所述,菌株ZL223是嗜碱芽孢杆菌B.pseudofirmus的一个与其它已报道成员不同的新菌株。

嗜碱芽孢杆菌是碱性水解酶的一个重要来源。

[4]

自1971年Horikoshi首次报道了产自Bacillussp.221的外泌型碱性蛋白酶以来,已报道了多种不同的来自于嗜碱芽孢杆菌的碱性蛋白酶,有关

。但

是已报导的B.pseudofirmus菌产生的蛋白酶,其反应的最佳温度为60℃-70℃,最佳pH为910-1110,不同于本文报道的ZL223菌的蛋白酶。菌株

B.pseudofirmus菌产生的蛋白酶也有报道

[18220]

ZL223产生的碱性蛋白酶在pH耐受范围,最适温度

和氧化剂耐受等方面展示了其应用潜力,而且该蛋白酶高的反应pH值,是研究酶分子碱适应性的一个很好的资源,值得进行进一步的研究。

表1　菌株ZL223的表型及生理生化特征

Table1　SomephenotypiccharacteristicsofstrainZL223andrelatedspeciesofBacillus

Characteristic

Strainsdesignations

Size(μm)018-110×510-710016-018×310-610015-016×310-410016-017×210-510015-016×210-510

SporeshapeOvalOvalEllipsoidalEllipsoidalEllipsoidalTemp1forgrowth(℃)15-4510-4515-5515-4510-45pHforgrowth710-1010810-1010710-1010910-1110910-1110NaClrangeforgrowth(%)0-150-160-120-160-16

-NO3reduction----+Hydrolysisof:Starch-w+-+Tween80-----/+Utilizationof:Ribosew++-+D2xylose++--+L2arabinose--+-+Galactose--+w+Rhanmose--+-wLactose--+--Melibiose--+-+Melizitose--+--D2raffinose--+-+D2tagatose----+Mannose-w+w+Inositol--+--22ketogluconate+---+T[15]T[15]T[15]

Strainsdesignations:1,strainZL223;2,B.pseudofirmusDSM8715;3,B.haloduransDSM497;4,B.clarkiiDSM8720;5,B.

T[15]

agaradhaerensDSM8721.+positive,-negative,wweakreaction.

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Isolation,identificationandenzymeprofilingofan

alkaliphilicproteaseproducingbacteriumJianguoHao

1,2

,YanfenXue,YanheMa113(LabofExtremophiles,InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofScience,Beijing100101,China)2

(GraduateUniversityofChineseAcademyofScience,Beijing100049,China)

Abstract:[Objective]Toisolateandcharacterizealkaliphilicbacteriawithproteaseactivity.[Methods]Protease2producingalkaliphileswereisolatedbyskimmilkagarmethod.Themorphological,biochemicalandphysiologicalcharacteristics,16SrRNAgenesequenceandDNA2DNAhybridizationweredeterminedtoidentifythetaxonomicpositionofstrainZL223.Meanwhile,theenzymecharacterizationoftheproteaseincludingoptimaltemperatureandpHrange,stabilityandoxidationresistanceweretestedbyusingcaseinhydrolysistest.[Results]AnewstrainnamedZL223wasisolatedfromBangeLakeinTibet,China.CellswereGram2positive,spore2forming,motilerods.GrowthpHrangewasfrom7.0to10.0,optimumatpH9.0.Growthtemperaturerangewasfrom15℃to45℃,optimumat37℃.TheG+CcontentofDNAwas40.4mol%.Phylogeneticanalysisbasedon16SrRNAgenesequencesshowedthatthestrainbelongedtothegenusBacillusandmostcloselyrelatedtoBacilluspseudofirmusOF4with98.6%sequencesimilarity.DNA2DNAhybridizationanalysisconfirmedthecloserelationshipofstrainZL223withBacilluspseudofirmuOF4(86%

relatedness).StrainZL223producedextracellularalkalineproteaseanditsmaximalenzymeactivitywasobservedat40CandpH12.0.[Conclusion]Baseonpolyphasictaxonomy,strainZL223wasanewmemberofBacilluspseudofirmus.Itproducedalkalineproteasewhichwasworthfurtherresearch.Keywords:Alkaliphile;Bacilluspseudofirmus;16SrRNAgene;DNA2DNAhybridization

(本文责编:王晋芳)

SupportedbytheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(2007AA021306,2006AA020202)

Correspondingauthor.Tel:+86210264807590;Fax:+86210264807616;E2mail:mayanhe@im.ac.cn

Received:27May2009/Revised:15June2009

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