禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

来源：帮我找美食网

第22卷　第3期　　　　　　　　　中　国　预　防　兽　医　学　报　　　　　　　　Vol.22,　No.32000年5月　　　　　　ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine　　　　　　　May　2000

李海燕,于康震3,辛晓光,邓国华

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,哈尔滨　150001)

摘要　用表达禽流感病毒(AIV)核蛋白基因的杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系μ统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术(rNP-ELISA)。其抗原最适包被量为0.6g/孔,待检血清最适稀释度为1:200,酶标抗体使用浓度为1:1000。根据对140份SPF鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为OD值大于0.15的血清样品为阳性。用rNP-ELISA检测150份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清及30份其它15种鸡疫病阳性血清均为阴性;检测A型AIV15个不同亚型(H1～H15)毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种AIV的SPF鸡第3天即能检出抗体,到第162天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在2.9%～7.2%和3.4%～9.8%之间。对

3138份鸡血清进行监测,rNP-ELISA与全病毒间接ELISA(AIV-ELISA)、琼脂扩散试验(AGP)及血凝抑制试验(HI)的符合率分别

为99.9%、97.1%、98.8%;并能100%检出AGP阳性及疑似、HI阳性的血清样品。试验证明,rNP-ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速、经济的血清学诊断技术。

关键词　禽流感;　重组核蛋白;　ELISA;　抗体检测

中图分类号　S8.43;　S852.65　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　1008-05(2000)03-0182-04

AnEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayEmployingRecombinantNucleoprotein

ForDetectionofAntibodytoAvianInfluenzaVirusinChicken

LIHaiyan,YUKangzhen3,XINXiaoguang,DENGGuohua

(AnimalInfluenzaResearchCenter,HarbinVeterinaryResearchInstituteofCAAS,Harbin150001)

Abstract　Anenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)employingrecombinantnucleoprotein(rNP)expressedinbaculovirussystemwasdevelopedfordetectionofantibodyagainstavianAinfluenzavirus(AIV)inchickensera.40-wellpolystyrenemicrotitrationplatewascoat2

μμedwiththerNPantigen(0.6g/100l/well)for15hat4℃.Theworkingtiterofenzyme-labeledanti-chickenIgconjugatewas1:1000and

thatofserumsampleswas1:200.Thesampleswithopticaldense(OD)greaterthan0.15werejudgedaspositivebasedonthedatafrom140seraofspecific-pathogen-free(SPF)chickens.The344serumsamplesfromSPFchickens(150serumsamples),non-immunizedchickens(194serumsamples)andthechickens(30serumsamples)infectedbyother15infectiouspathogensthanAIVwerenegativeintherNP-ELISA.Ontheotherhand,therNP-ELISAwasabletorevealallserumsamplesagainst15(H1～H15)AIVsubtypes,whichwerepositiveinagargelpre2cipitation(AGP)andhemagglutinatin-inhibition(HI)testsaswell.Furthermore,therNP-ELISAwasabletodetecttheserumantibodyfromchickensinfectedwithAIVstrainA/Turkey/England/69(H3N2)onasearlyas3rddaypost-inoculation(DPI)andthepositivedetectioncouldlast162DPI.TherNP-ELISAwasfoundmoresensitivethanAGPandHItests.ThevariantcoefficientsoftheODvaluewithinassayandbe2tweenassaysrangedfrom2.9to7.2%,andfrom3.4to9.8%respectively.Thetotalof3138serumsampleswereevaluatedbyrNP-ELISA,aswellaswholevirusantigenELISA(AIV-ELISA),AGPandHItests.ThecorrespondencebetweenrNP-ELISAandAIV-ELISAwas99.9%,betweenrNP-ELISAandAGPwas97.1%andbetweenrNP-ELISAandHIwas98.9%.TheresultsaboveshowedthattherNP-ELISAwasrapid,sensitive,economicandspecificforserologicallydiagnosisofAIVinfectioninchickens.

Keywords　Avianinfluenza;　Nucleoprotein;　ELISA;　Antibodydetection

　3Correspondingauthor

　　禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类病毒性烈性传染病。我国是世界第一养禽大

　3通讯作者(Email:yukz@public.hr.hl.cn)　收稿日期:1999-09-23

国,禽流感的防制直接关系到我国养禽业的持续、稳

定发展和人民的身体健康,早期快速诊断和血清学监测是预防、控制禽流感的前提条件。尽管AIV极易变异,但其核蛋白却高度保守,具有型特异性。我们在禽流感全病毒酶联免疫吸附试验(ELISA)[1]和

第3期　　　　　　　　　　　　李海燕等:　禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究　　　　　　　　　　　　183

斑点ELISA[2]研究的基础上,以重组杆状病毒表达的禽流感病毒核蛋白(rNP)为包被抗原,建立了rNP-ELISA诊断技术,可对禽流感进行快速诊断,具有高度特异性和敏感性,现报告如下。1　材料和方法

111　AIV毒株　A/Chicken/Xinjiang/1/96(XJ/96,H15N5),由哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心分

感染的鸡胚尿囊液(HA价1128～1256)接种10只于负压隔离器中饲养的48周龄SPF鸡,1.5～2.0ml/只,分别于接种后第0天、第3天、第5天、第7天、第11天、第15天翅静脉采血,以后每隔1周采血,分离血清,共206份;所有血清同时用重组核蛋白ELISA(rNP-ELISA)、全病毒ELISA(AIV-ELISA)、AGP和HI试验进行测定。2　结　果

211　抗原制备　将重组杆状病毒rB2的细胞表达

离、鉴定并保存,为禽流感病毒核蛋白基因的供体;

A/Duck/Ukraine/1/63(UE/63,H3N8)和A/Turkey/England/69(ED/69,H3N2)均由英国中心兽医实验室(CVL)惠赠,分别用于制备AI标准阳性血清及免疫接种SPF鸡的抗体监测。

112　禽流感全病毒抗原和酶标兔抗鸡Ig　由哈尔

产物经冻融、裂解、离心等处理共制备rNP抗原3

μμμ批,蛋白含量分别为2.0g/μl、3.1g/μl、4.2g/μl。

212　抗原的最适浓度及血清最适稀释度　利用方

μ阵滴定法将rNP抗原稀释成2.0g/μl,倍比稀释后包被40孔聚苯乙烯微量反应板;阴、阳性血清从110开始倍比稀释,按ELISA程序进行方阵滴定。当

μμ抗原以0.4～0.8g/100l包被反应板,血清作180

～320稀释时,阴、阳性血清OD值比值较大,结果理想。在以后的试验中,为使用方便,确定抗原的最

μμ适包被量为0.6g/100l、血清最适稀释度为1200。213　rNP-ELISA判定标准　将140份SPF鸡血清作1200稀释,在最适工作条件下,按ELISA程序测定,其OD值大小与频数分布直方图见图1。结果经统计学分析,140份SPF鸡血清OD值平均数(X)等于0.037,方差(S)等于0.036“,X+3S”等于0.15,由此得出rNP-ELISA的判定标准,即OD值大于0.15者判为阳性。

滨兽医研究所动物流感研究中心研制[1],全病毒抗

μ原蛋白含量2.96g/μl,酶标兔抗鸡Ig工作浓度

11000稀释(含50%甘油)。113　禽流感AGP和HI抗原、AI各亚型血清及标准阳性血清　均由哈尔滨兽医研究所动物流感研究中

心研制[3、。114　其它标准血清　鸡新城疫(ND)、鸡马立克氏病(MD)、鸡传染性支气管炎(IB)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、鸡传染性贫血(CIA)、鸡白痢(PD)、鸡鼻炎(IC)、鸡腺病毒感染(ADV)、鸡减蛋综合征(EDS-76)、病毒性关节炎(VA)、禽霍乱(FC)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡白血病(AL)、鸡痘(AP)、鸡慢性呼吸道病(CRD)标准阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成果推广部,共30分(每种2份)。115　待检血清　共计2523份,分别来自黑龙江哈

尔滨260份、大庆68份,辽宁大连283份,河北204份,上海102,江苏常州1020份,北京204份,山东蓬莱204份,安微178份(1日龄44份、11日龄59份、26日龄75份)。116　重组杆状病毒表达的AIV核蛋白抗原(rNP)　将XJ/96毒株感染的鸡胚尿囊液纯化后提取病毒RNA,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增NP基因[5],并克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中,与杆状病毒线性DNA(BAC-N-BlueDNA)共转染于Sf9昆虫细胞中,获得重组病毒rB2[6],将其细胞表达产物经冻融、超声裂解等处理制备rNP,并测其蛋白含量。117　ELISA、AGP、血凝(HA)及HI试验　ELISA按文献[7]程序进行,AGP、HA及HI试验均按常规方法进行[8]。118　SPF鸡的免疫接种及抗体监测　用AIVED/69

图1　SPF鸡血清OD值分布直方图

Fig.1ODvalueofSPFchickensera

214　rNP-ELISA特异性试验

21411　交叉试验:用rNP-ELISA对ND、MD、IB、IBD、CIA、PD、IC、ADV、EDS-76、VA、FC、ILT、AL、AP、CRD

等15种其它鸡疫病阳性血清(每种血清均设双份)

进行测定,结果均为阴性。21412　特异性阻断试验:将AI阳性血清从110开始倍比稀释,每个稀释度加入40%UE/63感染鸡胚

　　　　　　　　　　　　　　　　　中　国　预　防　兽　医　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　2000年184

尿囊液或健康鸡胚尿囊液,37℃作用45分钟,同时设不做任何处理的AI阳性血清对照。结果,标准阳性血清对照12560稀释后仍呈阳性反应;经含UE/63感染尿囊液处理后的阳性血清OD值明显降

低,1320稀释后呈阴性结果,其吸收值降低的百分率均超过50%;而经健康鸡胚尿囊液处理的阳性血清OD值没有明显变化(图2)。

测定,并同时做AGP和HI试验,结果完全一致,均呈明显的阳性反应。215　重复性试验　4份血清样品在同一批试验中每份样品平行设6个重复(批内重复);另外在6个不同试验日重复测定4份样品(批间重复)。结果,批内重复的吸收变异系数在2.9%～7.2%之间,批间重复的吸收变异系数在3.4%～9.8%之间。216　比较试验21611　rNP-ELISA与AIV-ELISA的比较:用rNP-ELISA和AIV-ELISA分别对150份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清、30份(每种2份)ND、MD、IB、IBD、CIA、PD、IC、ADV、EDS-76、VA、FC、ILT、AL、AP、CRD

等鸡疫病阳性血清检测结果均为阴性;对H1～H15各亚型AIV的35份阳性血清检测结果均为阳性。用rNP-ELISA和AIV-ELISA对206份人工接种AIV的SPF鸡血清进行检测,阳性数分别为191份和193份;对2523份现地鸡血清进行检测,阳性数分别为20份和19份(表1)。

图2　rNP+ELISA特异性阻断试验

Fig.2SpecificblocktestofrNP-ELISA

21413　对亚型血清的检测:用rNP作包被抗原对A

型禽流感病毒15种亚型毒株的高免血清进行ELISA

表1　rNP-ELISA和AIV-ELISA、AGP、HI对血清样品的比较性检测

Table1　ComparativedetectionofserumsamplesbyrNP-ELISA,AIV-ELISA,AGPandHI血清样品

Serumsamples

羽份

Number

rNP-ELISAAIV-ELISAAGPHI

SPF鸡血清

SPFchickenserumsamples

15030000

非免疫鸡血清

Non-immunizedchickensamples

1940000

各亚型血清

AIVsubtypeserumsamples

3535353535

其它疫病标准血清

SerumsamplesagainstOtherInfectiouspathogens

300000

免疫鸡血清

AIV-immunizedchickensamples

206191193116165

现地血清

Field-originserumsamples

25232019414

合　计

Total

3138246247155214

　3所示数据为阳性数　　3Numbersshowedwerepositivesamples

21612　rNP-ELISA与AGP、HI试验的比较:分别用rNP-ELISA、HI和AGP试验对10只人工接种AIV的SPF鸡进行抗体检测,结果如表2所示。分别用这3

15种(30份)其它鸡疫病阳性血清进行检测,结果均

为阴性;对35份人工接种AIV各亚型血清进行检

测,结果均为阳性。对206份免疫鸡血清和2523份现地鸡血清进行检测,有2518份血清用rNP-

种方法对150份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清、

第3期　　　　　　　　　　　　李海燕等:　禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究　　　　　　　　　　　　185

iELISA、HI和AGP检测结果均为阴性;另有211份

用rNP-ELISA检测结果为阳性的血清,而用HI和AGP检测阳性数分别为179份和120份。总之,对

3138份鸡血清进行检测,rNP-ELISA与AGP的符合率为97.1%(3047/3138),与HI的符合率为98.8%(3106/3138)。

表2　rNP-ELISA和HI、AGP对AIV实验感染SPF鸡血清样品的比较性检测

Table2　ComparativedetectionoftheserumsamplesfromSPFchickens

　infectedwithAIV,ED/69byrNP-ELISA,HIandAGP

感染后天数　　　

Dayspostinfection

rNP-ELISAHIAGP

0/100/100/10

38/100/100/10

510/1010/100/10

1110/1010/109/10

2210/1010/1010/10

509/99/98/9

719/99/96/9

999/96/96/9

1139/96/92/9

1626/93/90/9

阳性数

Positive/negative

　9/93

9/99/9

　　31只实验鸡死亡　31testchickendied

3　讨　论

311　诊断是及时采取正确防制措施的前提,错误的

诊断必然导致措施的错误,及时正确的定性诊断是禽流感综合防制中的关键。尽管禽流感病毒亚型众

多,变异性强,但其NP具有高度保守性,以NP为诊断抗原,可检测所有A型禽流感病毒抗体。本研究依据rNP的高度型特异性,建立了禽流感rNP-ELISA检测法,具有与AIV-ELISA同样的特异性和敏感性,其优点是抗原制备工艺简单、生物安全性高、成本低廉,易于大批量生产,更易满足现地对禽流感抗体监测和疫病诊断的需要,是检测血清中微量特异性抗体有效而实用的方法之一。3.2　rNP-ELISA与ND、MD、IBD等15种鸡疫病阳性血清没有交叉反应性,用该rNP抗原检出的抗体可中和AIV,对150份SPF鸡血清和194份非免疫鸡血清样品检测的结果均为阴性,说明制备的rNP抗原具有很高的特异性。对3138份鸡血清同时进行检测,rNP-ELISA与AIV-ELSA符合率为99.9%(3135/3138),与AGP符合率为97.1%(3047/3138),与HI符合率为98.8%(3106/3138);对人工接种AIVSPF鸡血清的检测,比HI早两天,比AGP早7天。因此,rNP-ELISA不仅具有与AGP、HI同样的特异性,而且具有更高的敏感性,用样微量,可在微克水平上

检测出血清中的禽流感抗体,是禽流感早期、微量诊断的一种实用的、有前途的方法。313　用rNP-ELISA可检测禽流感病毒各亚型阳性血清,并能检出已知各亚型禽流感病毒株及所有变异禽流感病毒株的阳性血清。目前,我们已将该技术及成套的成品试剂组装成诊断试剂盒,进行的田间试验取得了很好的效果。因此,rNP-ELISA可以在包括基层兽医防疫单位在内的各级基本实验室完成对禽流感的检测,是禽流感综合防制中疫病监测及快速定性诊断的有效手段。

参考文献

[1]李海燕,辛晓光,田国斌,等.中国畜禽传染病,1998,20(增刊):

157～159.

[2]李海燕,辛晓光,田国斌,等.中国预防兽医学报,1999,21(5):321

～324.

[3]王锡　,唐秀英,李金璋,等.禽流感诊断技术(农业部培训班讲

义)中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,1994,10.

[4]田国斌,唐秀英,于康震,等.中国畜传染病,1998,20(1):32～34.[5]邓国华,于康震.中国畜禽传染病,1998,20(3):132～135.[6]邓国华,于康震.中国预防兽医学报,1999,21(2):81～83.[7]李海燕,辛晓光,田国斌,等.中国畜禽传染病,1998,20(4):233～

235.

[8]王锡　,鞠复邦,王立男,等.中国畜禽传染病,1987,9(1):24～

26.

因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容

查看全文