第５期 贾涛，等．乳及乳制品巾羟脯氨酸的快速测定 ・７ｌ・ 乳及乳制品中羟脯氨酸的快速测定 贾 涛 ，李新丽 ，艾曼 ，赵厚民 （１．江苏省理化测试中心，江苏南京 ２１００４２；２．江苏省分析测试协会，江苏南京 ２１００４２） 摘要：研究了一种快速测定乳及乳制品中羟脯氨酸含量的方法，该方法水解时间缩短为１５ｍｉｎ，分光光度法比色定量，方法的定量 限为０．０５ ｇ／ｍＬ，具有良好的重现性，精密度ＲＳＤ＜４％，加标回收率为９５％一１０５％，研究数据表明该方法可以快速准确鉴定出 乳及乳制品中是否添加了皮革奶。 关键词：比色法；皮革奶；羟脯氨酸；快速水解 中图分类号：０６５７．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０２１ｘ（２０１５）０５—００７１—０３ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｏｆ Ｍｉｌｋ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｊ／ａ Ｔａｏ ，Ｌｉ Ｘｉｎｌｉ ，Ａｉ Ｍａｎ ，Ｚｈａｏ Ｈｏｕｍｉｎ （１．Ｐｈｙｓｉｃｓ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２ １００４２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｐｍｌｉｎｅ ｉｎ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗａｓ ｄｅｓｅｒｉｐｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏ １５ ｍｉｎ．Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ ｌｏｗｅｓｔ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｓ ０．０５ ｇ／ｍＬ，ａｎｄ ｈａｖｅ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｔｅｓｔ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．ＲＳＤ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ４％ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｉｏｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ９５％一１０５％．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈａｔ ｗｈａｔｈｅｒ ｔｈｅ ｌｅａｔｈｅｒ ｍｉｌｋ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｈｏｗ ｍｕｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｄａｉｙ ｐｒｒｏｄｕｃｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ；ｌｅａｔｈｅｒ ｍｉｌｋ；ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ “皮革奶”是指为了提高蛋白质含量而添加了皮革水解 １ 实验部分 １．１ 仪器 ＢＳＡ２２４Ｓ—ＣＷ分析天平（赛多利斯科学仪器有限公 司）；Ｄｅｈａ３２０ ｐＨ酸度计（梅特勒一托利多仪器公司）；ｕＶ一 １８０１紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；ＨＨ一 ６数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；ＤＨＧ一９１４３８５一ｍ 电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。 蛋白粉等禁用物质的鲜乳或乳制品的俗称，这类皮革水解蛋 白粉多来自皮革厂制作衣服、皮鞋的下脚料，其含有的六价 铬等有毒有害物质，严重影响人体健康甚至生命安全，所以 乳及乳制品中禁止添加皮革水解蛋白。现在对皮革奶的鉴 定方法主要是检测乳制品中是否含有羟脯氨酸，它作为动物 胶原蛋白中特有成分而存在，并且其含量高达１Ｏ％以上，而 乳蛋白、大豆蛋白等植物蛋白不含此成分 Ｊ，因此，可以利用 检测样品水解后是否含有羟脯氨酸来鉴定乳制品中是否添 加了皮革水解蛋白 Ｊ。 目前检测羟脯氨酸的方法主要有比色法‘３ 』、高效液相 法 以及氨基酸自动分析法 ，其中比色法因检测成本 低、检测速度快而应用最为普遍，基于实现快速、便捷、现场 检测等方面的考虑，本文研究了比色法检测皮革奶中羟脯氨 酸含量的快速检测技术。 一１．２ 试剂 实验中所用的试剂均为分析纯，水为超纯水； 硫酸溶液：将浓硫酸（Ｐ＝１．８４ｇ／ｍＬ）用蒸馏水稀释到浓 度为９ ｍｏＵＬ的硫酸溶液； 缓冲溶液（ｐＨ值＝６．８）：分别准确称取２６．０ ｇ一水柠檬 酸，１４．０ ｇ氢氧化钠，７８．０ ｇ三水乙酸钠，用５００ ｍＬ水溶解 上述试剂并转入１Ｌ的容量瓶中，加入２５０ ｍＬ的正丙醇，用 水定容； 般氨基酸的水解时间都在十几小时以上，所以检测方 氯胺Ｔ：准确称取１．４１ ｇ三水・Ｎ一氯一对甲苯磺酰胺 钠盐（氯胺Ｔ），加入１００ ｍＬ缓冲溶液溶解。临用前配置； 显色剂：称取１０．０ ｇ对二甲基苯甲醛，用３５ ｍＬ高氯酸 溶液［６０％（质量分数）］溶解，缓慢加入６５ ｍＬ异丙醇。临 用前配置； 羟脯氨酸标准储备液：称取５０ ｍｇ ４一羟基一ｏ【一毗咯甲 酸（羟脯氨酸）于１００ ｍＬ容量瓶，用水溶解，加入一滴硫酸溶 液，用水定容，此标准储备液浓度为５００ ｍＬ； 法的速度主要取决于前处理时间。如何优化实验条件缩短 前处理水解时间以实现快速检测是本方法研究的难点。 本研究结果表明，在保证精密度和准确度的前提下，经 优化后的快速水解方法可以将一般需要十几个小时的工作 缩减至１５ｍｉｎ，大大减少了样品前处理时间，提高了检测速 度，为鉴定乳制品中是否掺人动物水解蛋白提供了一种快速 高效的样品前处理方法。 收稿日期：２０１４—１２—１８ 基金项目：省社发项目资助（项目编号ＢＥ２０１１７８８） 作者简介：贾涛（１９７２一） 江苏南京人，高级工程师，主要从事分析测试研究工作。 ・７２・ 山东化工 ＳＨＡＮＤ０ＮＧ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０１５年第４４卷 标准使用液：将羟脯氨酸标准储备液稀释５倍，得到浓 度为１００￣ｇ／ｍＬ的标准使用液。 表１ 掺加动物胶原蛋白的奶粉中羟脯氨酸含量（％）的测定 １．３ 实验方法 １．３．１样品水解 称取固体样品０．２ ｇ（精确至０．００１ ｇ），液体样品１ ｇ（精 确至０．００１ ｇ），于２５０ ｍＬ锥形瓶中，加入７ ｍＬ硫酸溶液，用 表面皿盖住，放人１４０￣Ｃ烘箱内恒温１５ｒａｉｎ。趁热将水解产 物转移至５０ ｍＬ容量瓶中，用１０ ｍＬ硫酸分三次洗涤锥形 瓶，合并至上述容量瓶中。用水定容，摇匀。 １．３．２测定方法 准确移取一定体积的水解产物至５０ ｍＬ容量瓶中，定容 后羟脯氨酸浓度在０．２—２．４ Ｎｇ／ｍＬ之间，为待测液。移取 ４．０ ｍＬ上述待测液于比色管中，加入２．０ ｍＬ氯胺Ｔ溶液，混 合后于室温条件下放置２０±１ａｒｉｎ。加入２．０ ｍＬ显色剂，充 分混匀后将比色管迅速放入６０＇Ｅ水浴中加热２０ｍｉｎ。取出 比色管，用流动水冷却比色管至少３ｒａｉｎ，在室温下放置 ３０ｍｉｎ。用水做参比，于５５８ ｎｍ处用分光光度计测定吸收 值。同时做空白试验。 １．３．３标准曲线的制作及样品中羟脯氨酸含量的测定 用标准使用液配制标准曲线的系列浓度点：０．２、０．４、 ０．８、１．６、２．４ ｇ／ｍＬ，以空白做参比，以标准溶液的吸光度为 纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程 为Ｙ＝０．２０９７Ｘ＋０．００３１，Ｒ ＝０．９９９８。样品以扣除了空白 溶液的吸光值，从所得的标准曲线查看对应的浓度，然后折 算出样品中羟脯氨酸的含量。 ２结果与讨论 ２．１ 检测方法的比较 氨基酸分析仪可以测定羟脯氨酸含量，但在分析时要考 虑其他氨基酸的分离情况，除了前处理时间外，上机分析时 间都在１ｈ以上，在实现快速检测这方面受到，而且氨基 酸分析仪是大型仪器，价值昂贵，一般需要购买专用进口试 剂，检测成本较高。分光光度法检测羟脯氨酸，所需实验室 设备简单，同时检测的原理是基于羟脯氨酸衍生后的物质在 特定波长下的吸收，其他氨基酸的干扰可以忽略不计，样品 前处理简单、上机分析速度快（只需几分钟），为快速分析提 供了可能。 ２．２快速水解条件的确定 准确称取掺加动物胶原蛋白含量为２０％的奶粉０．２ ｇ 左右（精确至０．００１ ｇ）作为皮革蛋白奶，对样品前处理，然后 用比色法检测羟脯氨酸的含量。主要考察了硫酸浓度Ａ（３、 ６、９ ｍｏｌ／Ｌ）、硫酸体积Ｂ（５、７、１０ ｍＬ）、烘箱温度Ｃ（１３０、１４０、 １５０℃） 恒温时问Ｄ（１０、１５、２０ｍｉｎ）这四个因素，通过正交实 验确定最佳条件。实验结果表明，本实验的最佳实验条件是 置样品于７ ｍＬ浓度为９ｍｏｌ／Ｌ的硫酸条件下，在１４０￣Ｃ恒温 １５ｒａｉｎ。 ２．３方法精密度测定 准确称取掺加动物胶原蛋白含量为２０％的奶粉０．２ ｇ 左右（精确至０．００１ ｇ），按照上述最佳实验条件对样品进行 水解和检测，测定结果如表１所示，７次平行测量结果间的 ＲＳＤ为３．８６，表明该方法具有良好的精密度。 ２．４仪器检出限 对空白溶液平行测定２０次，根据表２所示的结果，计算 仪器检出限和检出下限分别为０．０１２、０．０４８ ｍＬ。 表２空白溶液吸光度（ｎ＝２０） ２．５方法回收率测定 准确称取６份０。２ｇ（精确至０．００１ｇ）奶粉样品（已知奶 粉中不含羟脯氨酸），加标浓度分别为５０、５０、１００、１００、２００ 和２００ ｇ，回收率见表３，采用本方法对样品进行测定，加 标回收率都在９５％～１０５％之间，平均加标回收率为９９． ２％。因此该方法可以准确测定胶原蛋白中羟脯氨酸的 含量。 表３加标回收率 ２．６方法的适用性 考虑到乳制品基体和动物胶原蛋白复杂程度的不同，可 能会对水解过程产生影响，为了考察本方法对多种乳制品及 胶原蛋白适用性，选取了市面上不同的胶原蛋白粉、奶粉等 样品，分别按照国标ＧＢ／Ｔ ９６９５．２３—２００８水解方法和本方 法处理，并对检测结果进行了比对。 第５期 贾涛，等：乳及乳制品中羟脯氨酸的快速测定 ・７３・ 由表４可知，鱼骨胶原蛋白粉、猪皮胶原蛋白粉都含有 ［４］国家质量监督检验检疫总局．ＧＢ／Ｔ ９６９５．２３—２００８肉与 羟脯氨酸，而掺加胶原蛋白的的检测数据也反映出测得的羟 肉制品羟脯氨酸含量测定［Ｓ］．北京：中国标准出版 脯氨酸的量与加入动物胶原蛋白的量成正比，因此若样品中 社，２００９． 检出羟脯氨酸，则说明有动物胶原蛋白的存在，可作为乳制 ［５］李景红，杨再山，孟祥晨．比色法检测乳中掺加的动物胶 品中是否添加动物胶原水解蛋白的依据。 原水解蛋白［Ｊ］．中国乳品工业，２００７，３５（９）：５０—５７． 同时两种水解方法检测的羟脯氨酸含量基本一致，相对 ［６］金苏英，林笑容，赵志红，等．高效液相色谱法测定奶粉及 偏差＜５％，说明本方法适用于多种乳制品，与国标水解时间 其他乳制品中的Ｌ一羟脯氨酸［Ｊ］．饮料工业，２００９，１２ １６ｈ相比，本方法水解时间只有十几分钟，在保证准确度的基 （７）：２８—３０． 础上，大大提高了检测速度，为现场快速鉴定乳制品中是否 ［７］邹晓莉，黎源倩，曾红燕，等．反相高效液相色谱法测定 添加了动物水解蛋白提供了技术支持。 人肌腱中的胶原蛋白［Ｊ］．色谱，２００６，２４（３）：２６３—２６６． ４总结 ［８］陈雄伟，王桂芬．用８３５—５０型氨基酸自动分析仪对羟脯 本实验建立了一种快速、简便、实用的检测乳制品中是 氨酸的测定方法［Ｊ］．氨基酸杂志，１９８５（４）：５—６． 否添加动物水解蛋白的方法，检测结果稳定，具有良好的精 ［９］曾暖茜，王洪健，周兴起，等．氨基酸自动分析仪对乳制 密度和准确度，本方法适合于快速定性定量检测乳制品是否 品中羟脯氨酸的测定方法研究［Ｊ］．现代食品科技， 为皮革奶，为流动式现场检测提供方法支持。 ２００８，２４（７）：７１９—７２１． 参考叉献 ［１０］张秀尧，梁晓蓉，蔡欣欣．氨基酸自动分析仪检测乳及 ［１］田艳玲．乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定方法［Ｊ］．中 乳制品中羟脯氨酸［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００９，１９ 国食品添加剂，２００８（３）：１４５—１４７． （１０）：２３０５—２３０６． ［２］永井裕，藤本大三郎［日］．胶原蛋白实验方法［Ｍ］．上 海：上海中医学院出版社，１９８８． （本文文献格式：贾涛，李新丽。艾曼，等．乳及乳制品中 ［３］陈楠瑜，余洁芝．乳与乳制品中羟脯氨酸的检测［Ｊ］．农 羟脯氨酸的快速测定［Ｊ］．山东化工，２０１５，４４（５）：７１—７３．） 业研究与应用，２０１１（４）：２Ｏ一２２． （上接第７０页） ［１］庞新华，张继，张宇．我国荔枝产业的研究进展及对 在上述单因素实验基础上选择影响较大的提取时间、液 策［Ｊ］．农业研究与应用，２０１４（４）：５８—６６． 固比、乙醇浓度、提取温度为考虑因素，选择每个因素的最佳 ［２］张粹兰，张名位，廖森泰，等．荔枝果肉不同极性多酚提 ３个水平，见表１，以多酚的总提得率为指标，做 （４ ）正交 取及其抗氧化活性比较［Ｊ］．华南师范大学学报（自然科 试验，结果见表２。 学版），２０１４（４）：１１６—１２０． 由表２分析结果可知，各因素对提得率影响顺序为：Ａ＞ ［３］冯卫华，于立梅，秦艳，等．荔枝果肉多酚的提取与分离 Ｂ＞Ｄ＞Ｃ，其中固液比的影响最大，提取温度的影响最小。 ［Ｊ］．食品研究与开发，２０１２，３３（７）．４８—５２． 根据正交分析可知，提取条件的最佳组合为Ａ Ｂ，Ｃ，Ｄ，，综合 ［４］熊何健，卢玉兰．荔枝壳中多酚氧化酶活性研究［Ｊ］．食 考虑实验爆沸情况（５０￣Ｃ以上爆沸出现）和能源损耗综合考 品科学，２００６，２７（１２）：１８２～１８５． 虑，提取温度可采用较低温４５℃，即选择Ａ Ｂ，Ｃ。Ｄ。。这一组 ［５］颜仁梁，刘志刚．荔枝核多酚类物质的分离与鉴定［Ｊ］． 合没有出现在正交设计的９个组合中，因此将Ａ Ｂ Ｃ Ｄ 组 中药材，２００９，３２（４）：５２２—５２３． 合和正交实验中提取率最高的Ａ Ｂ ｃ Ｄ 比较，提取率为 ［６］韩淑琴，李志锐，朱学良超声一微波协同萃取法提取龙 １．６８％，略高于后者。因此，正交试验得出ＵＭＡＥ法提取荔 眼壳总黄酮［Ｊ］．食品研究与开发，２０１４，３５（７）：３０—３３． 枝壳总黄酮最佳方案为Ａ Ｂ Ｃ，Ｄ。，即液固比２０％，乙醇浓度 ６０％，提取时间１０ｍｉｎ，提取温度４５℃。 （本文文献格式：赵文华，韩淑琴，王俊，等．超声一微波协同萃取 参考文献 法提取荔枝壳中多酚［Ｊ］．山东化工，２０１５，４４（５）：６８—７０，７３．）
