可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉、淀粉酶测定方法

一、 实验原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1 h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

二、 实验材料、仪器和试剂

1. 仪器设备

分光光度计，离心机，研钵，

2. 试剂

(1) 牛血清白蛋白 配成1000 μg/mL和100 μg/mL。

(2) 考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 90%乙醇中，加入85%（W/V）

磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL。此溶液在常温下可放置一个月。 (3) 90%乙醇

(4) 磷酸（85%，W/V）

三、 实验步骤：

1. 可溶性蛋白的提取

称取新鲜植物样品约0.5 g置于研钵中，加入5 mL 4oC下预冷的浓度为50 mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10 mL离心管中，在4 oC冰箱中静置10 min，于15000 rpm/min下冷冻离心25 min，上清液即为蛋白提取液。4 oC下保存备用。

2. 标准曲线的绘制

(1) 0-100 μg/mL标准曲线的制作

取6支试管，按下表数据配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1 mL。准确吸取所配各管溶液0.1 mL，分别放入10 mL具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min后，在595 nm下比色，绘制标准曲线。

配制0-100 μg/mL血清白蛋白液

管 号

100 μg/mL牛血清蛋白量(mL)

蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)

(2) 0-1000 μg/mL标准曲线的制作

另取6支试管，按表10-2数据配制0-1000 μg/mL牛血清白蛋白溶液各1 mL。与步骤（1）操作相同，绘出0-1000 μg/mL的标准曲线。

配制0-1000 μg/mL血清蛋白血液

管 号

7

8

9

10

11

12

1 0 1.0 0

2 0.2 0.8 0.02

3 0.4 0.6 0.04

4 0.6 0.4 0.06

5 0.8 0.2 0.08

6 1.0 0 0.10

1000 μg/mL牛血清白蛋白（mL）

蒸馏水量(mL) 蛋白质含量(mg)

0 1.0 0

0.2 0.8 0.2

0.4 0.6 0.4

0.6 0.4 0.6

0.8 0.2 0.8

1.0 0 1.0

3. 样品提取液中蛋白质浓度的测定

吸取样品提取液0.1 mL（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595 nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。

四、 结果计算与分析

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

CVaW

式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（mL）； a－测定所取提取液体积（mL）；

W－取样量（g）

淀粉酶活力测定

一、 实验原理

淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

二、实验材料、仪器和试剂

1. 仪器设备：

分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵。

2. 试剂：

（1）麦芽糖标准液(1mg/mL)：称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100。 （2）DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20 mL 12M NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。

（3）0.1M PH5.6的柠檬酸缓冲液：A液(0.1M柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1M柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55mL与B液145mL混匀，即为0.1M PH5.6的柠檬酸缓冲液。

（4）1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1M PH5.6的柠檬酸缓冲液中。

三、实验步骤

1. 麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净试管，编号，按下表加入试剂：

管 号 麦芽糖标准液（mL）

蒸馏水量(mL) 麦芽糖含量(mg) 3，5-二硝基水杨酸

1 0 2.0 0 2.0

2 0.2 1.8 0.2 2.0

3 0..6 1.4 0.6 2.0

4 1.0 1.0 1.0 2.0

5 1.4 0.6 1.4 2.0

6 1.8 0.2 1.8 2.0

7 2.0 0 2.0 2.0

摇匀，置沸水浴中煮沸5min，取出后流水冷却，以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度，以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品测定

取上述实验蛋白提取液于10mL试管中用蒸馏水稀释一定倍数，摇匀，40度恒温水浴中保温10min，加入1%淀粉溶液各1.0mL，在40度恒温水浴中再准确保温5min，加入3，5-二硝基水杨酸2.0mL，摇匀，置沸水浴中煮沸5min，取出后流水冷却，在540nm波长下比色测定光密度。

四、结果计算

淀粉酶总活力【麦芽糖毫克数/样品鲜重（g）*5分钟】=麦芽糖含量（mg）*淀粉原液总体积（mL）*稀释倍数/样品重（g）

可溶性糖及淀粉含量的测定

一、原理

本实验采用蒽酮比色法。在强酸条件下，蒽酮与可溶性糖（包括还原性糖和非还原性糖）作用生成蓝绿色糖醛衍生物，该蓝绿色颜色深浅与含糖量成正比，可在625 nm下进行比色测定。

二、仪器和试剂

1.仪器：

紫外-可见分光光度计；试管；移液管；离心机等。 2.试剂：

（1）蒽酮100 mg溶于50 ml浓硫酸（化学纯）中，当天配制当天使用。

（2）蔗糖标准液（1mg/ml）：精确称取0.1000 g蔗糖（分析纯），在小烧杯中加水溶解，定溶100 ml，加2-3滴浓硫酸。

（3）3 mol/L 盐酸：225 ml 盐酸 + 775 ml 水；

（4）3 mol/L 氢氧化钠：120 g 氢氧化钠 + 1 000 ml 水；

（5）葡萄糖标准液：精确称取0.1000 g葡萄糖（分析纯），在小烧杯中加水溶解，定溶100 ml，加2-3滴浓硫酸。

三、测定方法

1．样品处理

取样品0.5克左右，放入10 ml离心管中，加入7 ml水，沸水浴20分钟，取出冷却，3500转/分离心10分钟，取上清，重复提取2次收集上清用水定容50 ml，作为待测样品，每个样品重复一次。

测糖后离心管中的残渣加入8 ml盐酸，煮沸45分钟，冷却，把残渣转移到50 ml容量瓶中，加入8 ml氢氧化钠，定容。（1）取1 ml上清液于25 ml容量瓶，定容；（2）取1 ml上清液，加入4 ml蒽酮，摇匀，沸水浴5分钟，冷却，620 nm下比色。

2. 标准曲线的配制

2.1 可溶性糖含量的标准曲线

准确吸取1mg/ml的蔗糖标准液5ml，加水定容50ml得浓度为0.1mg/ml的蔗糖标准液，取6支试管，按下表加入：

可溶性糖标线 0.1mg/ml蔗糖（ml） 水（ml）

.5

蔗糖浓度（μg/ml） 蒽酮试剂（ml）

.0

同时取待测液0-0.5 ml，加入蒽酮4.0 ml，在40水浴中显色10-15分钟。 2.2 淀粉含量的标准曲线

准确吸取1mg/ml的葡萄糖标准液5ml，加水定容50ml得浓度为0.1mg/ml的蔗糖标准液，取6支试管，按下表加入：

淀粉含量标线

0.1mg/ml葡萄糖（ml） 水（ml）

.0

0 0 2

1 0.2 0.8

2 0.4 0.6

3 0.6 0.4

4 0.8 0.2

5 1.0 0

0

3 4

4.0 13.

6

4.0 26.

9

4.0 39.

2

4.0 53.

5

4.0 66.

0 0 1

1 0.2 1.3

2 0.4 1.1

3 0.6 0.9

4 0.8 0.7

5 1.0 0.5

葡萄糖浓度（μg/ml） 蒽酮试剂（ml）

.0

0 8

20 4.0

40 4.0

60 4.0

80

0 4.0

104.0

四、计算方法

可溶性糖含量（%）=C*V/（A*W*106）*100 V：提取液体积； A：测定取取体积； W：质量。

淀粉含量（%）=C*V*0.9/（A*W*106）*100 V：提取液体积； A：测定取取体积； W：质量。