钩吻B2组分对Hela细胞增殖和细胞周期的影响

20JHunanNormalUniv(MedSci)

　2008,5(4)

钩吻

B2组分对Hela细胞增殖和细胞周期的影响

安飞云1,陈翠梅1,梁维君2

3

(1.中南大学公共卫生学院,湖南长沙410078;2.湖南师范大学医学院,湖南长沙410006)

　　[摘要]　目的:探讨钩吻醇提2氯仿萃取(GW2B2)组分对Hela细胞生长与增殖以及细胞周期的影响。方法:采用XTT法分析细胞生长与增殖,Timelapse显微镜观察细胞生长和形态,流式细胞仪检测凋亡和细胞周期,综合评价GW2B2组分抗Hela细胞的作用。结果:GW2B2具有明显抑制Hela细胞生长与增殖的作用,1μL/mLGW2B2组分处理的Hela细胞生长速度明显μ降低,在2～5L/mL的剂量范围内,细胞生长与增殖能力基本完全被抑制。GW2B2组分处理后,Hela细胞主要的形态学变化μL/mL、为贴壁能力丧失,悬浮细胞增多,细胞分裂阻滞,部分细胞崩解破碎。GW2B2组分能明显的诱导Hela细胞凋亡,1

2μL/mL和5μL/mLGW2B2组分处理72h后,Hela细胞的凋亡率分别可达8116%、36183和61132%,而对细胞周期的影响主

要是G2/M期阻滞,同时对G0/G1期也有一定的阻滞作用。结论:GW2B2组分具有抑制Hela细胞增殖、诱导凋亡,具有明显的抗肿瘤细胞的作用;GW2B2组分对细胞周期的影响主要是G2/M期阻滞,随后可诱导细胞的凋亡。

[关键词]　钩吻;Hela细胞;细胞增殖;细胞周期

[中图分类号R28515]　　　[文献标识码]A　　　[文章编号]1673-016x(2008)04-0020-04

EffectofB2ComponentofGelsemiumElegansBenth

onHelaCellsProliferationandCellCycle

ANFei2yun1,CHENCui2mei1,LIANGWei2jun2

(1.PublicHealthSchoolofCentreSouthUniversity,Changsha410078,China;2.MedicalCollege,HunanNormalUniversity,Changsha410006,China)

[Abstract]Objective　TostudyoneffectofcompoundofethanolandchloroformextractionfromGelsemium

elegansBenth(GW2B2component)onHelacellsproliferationandcellcycle.Methods　Cellproliferationwasde2tectedbyXTTmethod,cellgrowthmorphologicalchangeswasobservedwithTime2lapseinversionmicroscope,ap2optosisandcellcyclewasanalyzedbyflowcytometer,comprehensiveevaluatedtheeffectsofextractofGelsemiu2moncellgrowthandproliferation.Results　GW2B2componentobviouslyinhibitedHelacellgrowthandprolifera2tion,growthspeedofHelacellwasdecreasedobviouslyatconcentration1μL/mL,andcellgrowthandproliferation

μL/mor5μabilitywasinhibitedalmostcompletelyatconcentration2L/mL.DistinctmorphologicalabnormitycanbeobservedduototreatmentwithGW2B2component,suchasadhesivecapabilityofcellslose,suspensioncellsin2crease,celldivisionblockage,andapartofcellsbrokenandfragmentized.Apoptosiscanbedistinctlyinducedby

GW2B2component,apoptosisratewererespectively8116%,36183and61132%whenHelacellswastreatedwithGW2B2componentatconcentration1μL/mL,2μL/mLand5μL/mLfor72h.PrimaryeffectofGW2B2componentoncellcyclewasG2/Mstageblockage,anddefiniteG0/G1stageblockagecanbealsoobservedatsametime.Conclusion　GW2B2componentcaninhibitedcellproliferation,inducedcellapoptosis,whichindicateditsunam2

3收稿日期:2008-10-20

基金项目:西班牙-中国国际科技合作项目(2002CN0008);湖南省科技计划项目(04SK3058)

作者简介:安飞云(1953—),男,湖南新邵人,教授,主要从事分子毒理学与药物毒理学研究。Tel:86-731-4805461,Email:afy53@

vip.sina.com

通信作者:梁维君(1954—),男,湖南常德人,教授,主要从事流行病学与卫生统计的研究。Tel:86-731-8912598,Email:Liangwj@

168.yahoo.com

钩吻B2组分对Hela细胞增殖和细胞周期的影响　安飞云等21

biguouseffectsontumorcell.PrimaryeffectsoncellcycleofGW2B2componentwasG2/Mstageretardation,andthenapoptosiscaninduced.

[Keywords]GelsemiumelegansBenth;Helacell;cellproliferation;cellcycle　　钩吻(GelsemiumelegansBenth),又名猪人参、大茶药、断肠草等,具有败毒抗癌、散结治疮、消肿止痛等功用。近年来,钩吻应用逐渐广泛,从过去的熏、洗、敷、涂、擦等外用方式,逐渐发展成为酊剂、浸膏、合剂、注射液等多种剂型,并开始应用于临床某些疾病的治疗。据报道,钩吻外用可治疗风湿、疔疮毒肿、跌打损伤以及某些皮肤病,口服干粉或注射提取液具有镇痛和抗肿瘤作用[1-3]

。通过初步的实验研究表明,抗肿瘤作用是钩吻的主要的药理作用之一,钩吻总生物碱能明显抑制人HepG22肝肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡[4];钩吻生物碱单体钩吻素子能抑制DNA的合成,阻止人结肠腺癌LoVo细胞由G1期向S期的转化[5];钩吻醇提取物对小鼠移植性肿瘤具有明显的抑制作用[6]

,钩吻醇提水沉萃取组分对Hela细胞和HL260细胞的生长增殖具有明显的抑制作用[7-8],但是钩吻抗肿瘤作用的有效成分尚不十分清楚,抗肿瘤作用的特点和机制也未见报道。本试验在以前工作的基础上,对钩吻醇提水沉组分,进一步采取碱化和氯仿再萃取的提取过程获得钩吻醇提2氯仿萃取组分,并在体外研究其对Hela细胞生长增殖和细胞周期的影响,旨在为钩吻抗肿瘤作用有效成分的进一步分离纯化以及钩吻抗肿瘤作用的特点与机制提供一定的试验依据。

1　材料和方法

111　GW2B2组分的制备

称取钩吻(产地广西)根茎干燥粉末20g,加50mL无水乙醇旋转振摇提取6h,连续2次,合并提取液。醇提取液经离心减压加热浓缩至10mL,加入50mL的去离子蒸馏水,混匀后静置2～3小时,1800rpm离心10min,去上清。沉淀用去离子蒸馏水洗涤2次,加无水乙醇充分溶解,1800rpm离心10min取上清后浓缩至干。浓缩干品用5mL011%NaOH溶液充分溶解,加入6mL氯仿,反复颠倒充分混匀。置室温静置两相分层后,1500rpm离心10分钟,取氯仿相37℃旋转蒸发加热干燥后,用2mL的

DMSO溶解,10000rpm离心10min,取上清经012μm的滤器过滤除菌后,-20℃冰箱保存备用。112　细胞培养和处理

Hela细胞株由西班牙Salamanca大学癌症研究

所提供。细胞培养采用DMEM培养液,补充10%(v/v)胎牛血清、2mmol/L的L2谷氨酰胺、100u/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素、24μg/mL的庆大霉素。细胞增殖实验采用96孔培养板,细胞形态学观察采用50mL培养瓶,细胞周期分析采用6孔培养板,分别加入一定体积的细胞悬液后置37℃、含5%CO2的培养箱培养过夜。GW2B2组分处理剂量分

别为1μL/mL、2μL/mL与5μL/mL,处理时间设置为24h、48h与72h。113　分析方法

细胞增殖用酶标仪(MicroplateReader,Bench2mark)检测,测定波长480nm,参考波长650nm,检测试剂盒购自Merck公司(XTT法)。细胞形态学分析采用倒置摄像显微镜(Axioverts100,Zeiss),在规定的时点定时摄取细胞影像。细胞周期分析采用流式细胞仪(BectonDickson,FACScalibur,PI染色法),即在细胞处理一定时间后按常规收获细胞,用PBS洗涤后,加2mL70%乙醇混匀4℃过夜。分析

前用PBS洗涤细胞3次,加入520

μL的PI混合液(含PBS500μL、50μg/mLPI10μL、5μg/mLRNaseA10μL),避光振摇混匀4小时后采用流式细胞仪检测单个细胞DNA含量。

2　实验结果

211　对Hela细胞增殖的影响

Hela细胞加入不同剂量的GW2B2组分后分别

于24h、48h和72h检测Hela细胞的增殖速率,由表1可见,GW2B2组分各剂量对Hela细胞生长增殖速率均有不同程度的影响,处理24小时后,210ul/mL和510ul/mL剂量组细胞增殖受到明显的抑制,与同期对照组相比较,差异有高度显著性(P<0101)。在随后的48h与72h后,110ul/mL剂量组细胞亦受到明显的影响,增殖速率明显降低,而210ul/mL与510ul/mL剂量组细胞的增殖几乎完全受抑制。212　对Hela细胞形态和生长方式的影响

对照组细胞培养48h后,呈扁平不规则多角形,细胞形态完整,核仁明显,贴壁生长良好。GW2B21μL/mL处理48h后细胞密度和贴壁能力降低,圆型细胞数量增加。2μL/mL处理48h后,相当数量

22

的细胞变圆、光折度降低和丧失贴壁能力,长梭状和漂浮的桑植样细胞明显增加,部分贴壁细胞胞膜皱

μL/mL缩、胞浆浓缩,同时可见许多凋亡样细胞。5处理48h后,仅见少量残存的贴壁细胞,且多呈条索

状,绝大部分细胞丧失贴壁能力,漂悬于培养基内。细胞光折度明显降低,凋亡样细胞进一步增多,并可见明显的细胞崩解和核碎裂现象(图1)。

213　诱导Hela细胞的凋亡

Hela细胞经GW2B2组分处理后,DNA发生降解,亚二倍体细胞比例增多,流式细胞仪检测可见特殊的亚二倍体峰,表明GW2B2组分具有明显的诱导Hela细胞的凋亡(图2),并存在明显的剂量2效应和

湖南师范大学学报(医学版),2008,5(4)

时间2效应关系(表2,图2)。214　对Hela细胞周期的影响

通过消除亚二倍体细胞的干扰作用后,分析

μL/mL剂量组24h细胞周Hela细胞周期的变化,1

期与对照组比较无明显改变,48h与72h后G2/MμL/mL和5μL/mL剂量组期细胞比例稍有增加。2

细胞周期改变十分明显,在24h时可见G0/G1细胞比例明显减少,而G2/M期细胞比例明显增加,表明

GW2B2组分明显的阻滞了G2/M期的细胞分裂。GW2B2组分处理48h与72h后,G2/M期细胞比例仍远高于相应的对照组,但相对24h的比例有所降低,可能为阻滞于G2/M期的细胞凋亡所致。

表1　GW2B2组分对Hela细胞生长增殖的影响(光密度值,x�±s,n=4)

处理时间(h)

0244872

3

对照组

01445±0109401884±0103211203±0107211585±01053

3

33

μL/mL)GW2B2组分(

11001817±0102711049±01033

3

210

3333

510

33

01552±0103101619±01025

01517±01009

01476±010123301316±010093

3

11349±104283301768±0104433

　　注:表示与对照组比较,表示P<0105,表示P<0101

图1　GW2B2组分处理后Hela细胞形态学的改变(10×20)

钩吻B2组分对Hela细胞增殖和细胞周期的影响　安飞云等

表2　GW2B2组分诱导的Hela细胞凋亡率(%)

处理时间(h)

244872

23

对照组

017201850193

GW2B2组分(μL/mL)

1μL112231328116

2μL41711817236183

5μL/3mL251853614561132

图2　GW2B2组分对Hela细胞周期的影响表3　GW2B2组分对Hela细胞周期的影响(%)

处理时间

(h)

G0/G1

244872

531456618070184

S15124121989160

G2/M311302012119157

G0/G1331195510148129

GW2B2组分(μL/mL)

对照组

μL/mL2

S11191916320196

G2/M541903513530176

G0/G1331784917638150

μ5L/mL

S121781412625162

G2/M531443519935187

3　讨论

钩吻抗肿瘤作用的有效成分和机制尚不十分清楚,一般认为主要与钩吻所含的生物碱有关。钩吻乙醚提取混合液对人肺腺癌细胞系增殖能力有明显影响,表现为增长速度减慢、有丝分裂指数下降、细胞死亡率明显增加[9];钩吻醇提水沉组分对Hela细胞和HL260细胞的增殖与细胞周期均有明显的影响

[7-8]

体峰,提示钩吻总碱对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用可能与其诱导肿瘤细胞的凋亡相关。本实

验采用的醇提2氯仿萃取组分,薄层层析分析可检测到7种生物碱,除对G0/G1期细胞的直接作用外,对G2/S细胞也有明显的作用,表现为明显的G2/M细胞周期阻滞,随后出现凋亡,钩吻醇提2水沉组分主要是作用于G0/G1期Hela期细胞,而G2/M细胞

[7]

周期阻滞不明显,提示钩吻可能存在着多种具有不同生物学作用的抗肿瘤有效成分。参考文献:

[1]刘道荣,黄文斌,杨朋,等.钩吻应用的研究进展[J].时

[4]

。钩吻含有多种生物碱,其抗肿瘤作用的活

性与机制有所不同,钩吻素子对人结肠腺癌LoVo细胞的作用主要是通过抑制DNA的合成,阻止细胞由G1期向S期的转化而诱导凋亡

[5]

。钩吻总碱处

理的HepG2肝癌细胞DNA直方图有明显的亚二倍

珍国药研究.1995,6(1):41-43.

(下转第27页)

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达　袁仕善等27

染血清所识别,提示该蛋白不是典型的血清学抗原。下一步研究将利用重组蛋白免疫小鼠,观察其诱导抗日本血吸虫感染的免疫保护效果,从而为开发新的血吸虫病防治疫苗提供科学依据。参考文献:

[1]FenwickA,WebsterJP.

Schistosomiasis:challengesfor

control,treatmentanddrugresistance[J].CurrOpinIn2fectDis,2006,19(6):577-582.

[2]童群波,刘述先,李小红,等.日本血吸虫嗜肌素样蛋

白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2007,19(4):247-251.

[3]HuW,Yan,Q,Shen,DK,etal.Evolutionaryandbiomed2

icalimplicationsofaSchistosomajaponicumcomplementaryDNAresource[J].NatureGenetics,2003,35(2):139-147.

[4]曹玲.我科学家公布日本血吸虫“基因天书”[J].发明

与创新,2006,7(7):28.

(上接第23页)

[2]王坤,肖艳芬,余晓玲,等.钩吻对小鼠急性辐射损伤的

保护作用[J].中华放射医学与防护杂志,2002,22(2):

111-112.

[3]周名璐,黄聪,杨小平.钩吻总碱的镇痛、镇静及安全性

研究[J].中成药,1998,20(1):35-36.

[4]王寅,方云峰,林文,等.钩吻总碱对肝癌细胞HepG2的

体外抑制作用[J].中药材,2001,24(8):579-581.

[5]迟德彪,雷林生,金宏,等.钩吻素子体外诱导人结肠腺

癌LoVo细胞凋亡的实验研究[J].第一军医大学学报,

2003,23(9):911-913.

[5]罗秀菊,袁仕善,易新元,等.日本血吸虫CAI基因的亚

克隆表达与免疫保护效果研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2003,21(6):353-356.

[6]鞠川,彭建新,徐斌,等.日本血吸虫钙磷蛋白基因的克

隆、表达及其进化分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2006,24(5):360-365.

[7]杨忠,徐斌,王玮,等.日本血吸虫腺苷脱氨酶基因的

克隆和融合表达[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,

2007,25(1):6-11.

[8]黄成玉,卢艳,王玮,等.日本血吸虫弹性蛋白酶基因的

克隆、表达及虫期特异性转录[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2007,25(5):359-363.

[9]王阳阳,刘淼,朱绍春,等.日本血吸虫表膜蛋白Tet2

raspanin22A基因的克隆?表达与鉴定[J].中国寄生

虫学与寄生虫病杂志,2008,26(1):21-24.

[10]袁仕善,陈欲晓,曾宪芳,等.日本血吸虫成虫脲溶

42kD蛋白的分离及其初步诊断应用[J].湖南师范大学

学报(医学版),2004,1(1):1-4.

[6]杨帆,陆益,李艳,等.钩吻提取物抗肿瘤作用的实验研

究[J].广西中医药,2004,27(1):51-53.

[7]丁建农,安飞云,曾明.钩吻提取液对Hela细胞生长增殖

和细胞周期的影响[J].中国现代医学杂志,2005,15

(2):230-232.

[8]梁维君,安飞云,曾明.钩吻提取液对HL260细胞生长增

殖和细胞周期的影响[J].湖南师范大学学报(医学版),

2004,1(1):39-43.

[9]陆健敏,齐子荣,刘国廉,等.钩吻碱注射液对肿瘤细胞

增殖能力的影响[J].癌症,1990,9(6):472-474.