6.外源性DNA残留量测定法

在进行外源性DNA残留量测定时，可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。

第一法 DNA探针杂交法

供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA残留量。

试剂 （1）DNA标记和检测试剂盒

（2）DNA杂交膜 尼龙膜或硝酸纤维素膜

（3）2%蛋白酶K溶液 称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分装后储藏于-20℃备用。

（4）3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分装后储藏于-20℃备用。

（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用盐酸调pH至8.0。

（6）5.0mol/L NaCl溶液。

（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0） NaOH溶液调pH至8.0。 （8）20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液 用盐酸调pH至7.2。

（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0） 量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0）、5.0mol/L NaCl溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml，加灭菌水至10ml。

（10）TE缓冲液（pH8.0） 1mol/L Tris溶液（pH8.0）1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml，加灭菌水至1000ml。

（11）1%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液稀释至刻度，摇匀。用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。

（12）DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50µl，加TE缓冲液至10ml。

用于探针标记和阳性对照的DNA制备 由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考以下方案，具体可参考《分子克隆实验指南》（美J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（美F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。

1. 将待提取的细胞基质悬浮的细胞浓度调整为107个/ml（细菌则为108个/ml）；

2. 量取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400µl混匀，37℃作用12~24h； 3. 加入饱和苯酚溶液450µl，剧烈混匀，10 000rpm，10min； 4. 转移上层液体，以饱和苯酚溶液450µl重复抽提1次；

5. 转移上层液体，加入三氯甲烷450µl，剧烈混匀，10 000rpm，10min；

6. 转移上层液体，加入pH 5.2的3mol/L醋酸钠溶液40µl，充分混匀，再加入-20℃以

下的无水乙醇1ml，充分混匀，-20℃以下作用2h，15 000rpm，15min； 7. 用适量-20℃ 70%乙醇溶液洗涤沉淀1次，15 000rpm，15min，弃上清； 8. 将沉淀吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切； 9. 酚-三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。

用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度，应无RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.0~2.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.2~1.0）.

用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声处理，使其片段大小适合DNA杂交和探针标记。

阳性对照品的DNA浓度计算：DNA浓度（µg/ml）=50X A260 阳性对照品可分装与适宜的小管中，-20℃以下保存，长期使用。 探针的标记：按说明书进行

测定法：1.蛋白酶K预处理

按下表对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样，混合后37℃保温4h以上，以保证酶切反应完全。

供试品 D1 D2 D3 阴性对照 加样量 2%蛋白酶K溶液 蛋白酶缓冲液 3%牛血清蛋白溶液 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 1µl 1µl 1µl 1µl 1µl 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl 适量 适量 适量 适量 加水至终体积 200µl 200µl 200µl 200µl 200µl 根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100µl含1人份剂量；如成品使用剂量较大，而供试品的蛋白质含量较低，可用DNA稀释液将供试品稀释至每100µl含1/10或1/100人份剂量。

D1、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA 1000ng，然后依次10倍稀释成10ng/100µl（D1）、1ng/100µl（D2）、100pg/100µl（D3）3个稀释度；如成品使用剂量较大，而DNA限量要求（100ng/剂量）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA稀释成100pg/100µl（D1）、10pg/100µl（D2）、1pg/100µl（D3）。阴性对照为DNA稀释液，空白对照为未进行蛋白酶K预处理的TE缓冲液。

当供试品1/100人份剂量大于100µl时，终体积也随之增大，一般为供试品体积的1倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶K的活性。

2%蛋白酶K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1:20，蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1:10。 加入3%牛血清蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质，与供试品（通常为蛋白质）的酶切条件一致；如供试品为其他物质，则改为其他相应物质。 若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和苯酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品DNA（阳性、阴性对照也应再次提取DNA，与供试品溶液平行）。 2. 点膜 用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置100℃水浴加入10min，迅速冰浴冷却，8 000rpm，5s。用抽滤加样器点样于杂交膜（因由蛋白质沉淀，故视沉淀多少确定加样量，避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阳性对照、空白对照加样体积应一致，或按同样比例加样）。晾干后置80℃真空干烤1h以上。

3. 杂交及显色 按试剂盒使用说明书进行。

结果判定：阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量想对应，呈一定的颜色梯度；阴性对照、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成立。将供试品与阳性对照比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。 第二法 荧光染色法

应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm出进行检测，在一定的DNA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与DNA浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的DNA残留量。

试剂：1. 1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH7.5） 用盐酸调pH至7.5。

2. 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5） 用10mol/L的NaOH溶液调pH至7.5。 3. TE缓冲液（pH7.5） 1mol/L Tris溶液（pH7.5）1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5）0.2ml，加灭菌水至100ml。

4. 双链DNA荧光染料 按试剂使用说明配置

5. DNA标准品 取适量DNA标准品溶于TE缓冲液中，制成100µg/ml DNA标准品，于-20℃保存。DNA标准品浓度计算：DNA浓度（µg/ml）=50 x A260 DNA标准品溶液制备 用TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准品溶液。

测定法：1. 精密量取DNA标准品溶液和供试品溶液各400µl于1.5ml离心管中，分别加入新配制的双链DNA荧光染料400µl，混匀，避光室温放置5min。

2. 取250µl上述反应液于96孔黑色酶标板中，并作3个复孔。用荧光酶标仪在激发波长480nm、发射波长520nm处测定荧光强度。

3. 以TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，求得直线回归方程（相关系数应不低于0.99），将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程，求出供试品中DNA残留量。

注意事项：1. DNA残留量在1.25~80ng/ml内，本法线性较好，供试品DNA残留量在该范围内可定量测定；当DNA残留量低于1.25ng/ml时应为限量测定，表示为小于1.25ng/ml。

2. 供试品首次应用本法测定时需要进行方法学验证，验证内容至少包括精密度试验和回收率试验。若供试品干扰回收率和精密度，应采用适宜方法稀释或纯化DNA（参见本项目第一法）以排除干扰。需要纯化DNA后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率试验，并用回收率对测定结果进行校正。