导言
以下描述的这些检测将使确定特定微生物不存在或数量在限度内的测定得以进行，这些微生物可以在描述的条件下进行检测。
这些测试主要设计用于测定某种物质或制备品是否符合已确立的微生物质量标准。当用于此目的时，遵循以下所给的说明，包括待取样品的数量，并按照以下所述来解释结果。
可以使用替代的微生物规程，包括自动化方法，只要它们与药典方法的同等性得到论证。
通用规程
按照在非无菌产品微生物学检查：微生物计数检查法<61>中的描述进行样品制备。 如果供试品具有抗菌活性，则按照非无菌产品微生物学检查：微生物计数检查法<61>中的描述尽可能将其去除或中和。
如果表面活性物质被用于样品制备，则必须按照在非无菌产品微生物学检查：微生物计数检查法<61>中的描述来论证其对微生物不具毒性以及其与所使用的任何灭活剂的兼容性，。
培养基的生长促进和抑菌性能以及测试的适用性
在存在供试品的情况下，此项测试检测微生物的能力必须得到确立。如果在测试性能或产品中作了变更且这些变更可能影响测试的结果，则其适用性必须得到确认。
供试菌株的制备
按下面所述，使用标准化的稳定供试菌株悬浮液。使用菌种保存技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始不超过5代。
好氧微生物
将每个供试细菌菌株单独置于装有大豆酪蛋白消化物肉汤培养基或者大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中容器内，在温度30o至35 o之间培养18至24小时。将白色念珠菌的供试菌株单独置于（沙氏）葡萄糖琼脂培养基或者（沙氏）葡萄糖肉汤中，在温度20o至25 o之间培养2至3天。 金黄色葡萄球菌 如ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83,
或 NBRC 13276
绿脓杆菌 如ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP
82.118, 或NBRC 13275
Esherichia coli 大肠杆菌 如ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP
53.126, 或NBRC 3972
沙门氏肠道菌，肠道血清型为鼠伤寒沙如ATCC 14028 门氏菌，作为替代品
沙门氏肠道菌，肠道血清型为阿邦尼沙如NBRC 100797, NCTC 6017, 或 CIP 门氏菌 80.39 白色念珠菌 如ATCC 10231, NCPF 3197, IP 48.72,
或NBRC 1594
使用pH值7.0的缓冲氯化钠—蛋白胨溶液或pH值7.2的磷酸盐缓冲液来制备检测供试悬浮液。悬浮液在2小时内使用，或在存放于2o至8 o的情况下，在24小时内使用。
梭状芽孢杆菌
使用生孢梭菌如ATCC 11437 (NBRC14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 或 ATCC 19404 (NCTC 532或 CIP 79.3)。于温度30o至35 o，厌氧条件下，在梭状芽孢杆菌强化培养基里将梭菌供试菌株培养24至48小时。作为制备然后稀释新鲜的梭状芽孢杆菌体细胞悬浮液的替代方法，一种稳定的孢子悬浮液被用于检测接种。此稳定孢子悬浮液可以在2o至 8o温度内保存，期限需验证。
阴性对照
为确认测试条件，用选定的稀释液代替供试制备品进行阴性对照实验。此试验中必须没有微生物的生长。当测试的样品如样品测试方法描述一样，阴性对照也适用。
培养基的生长促进和抑菌性能
检测每批已制备的培养基和每批由脱水培养基或培养基成分制备培养基。按表1中所描述的内容来验证相关培养基的适用性能。
表1. 培养基的生长促进、抑菌、指示性能
检测/培养基 特性 供试菌株 胆汁耐性革兰氏阴性菌的检测 肠道菌增菌肉汤培养基 生长促进 大肠杆菌 抑制
生长促进+指示
紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基
绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 绿脓杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 肠道伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌 阿邦尼沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 肠道伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌 阿邦尼沙门氏菌 大肠杆菌
大肠杆菌的检测 麦康凯肉汤 麦康凯琼脂
生长促进 抑制
生长促进+指示
沙门氏菌的检测
氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤 培养基 生长促进
抑制
木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基 生长促进+指示
指示
绿脓杆菌的检测 生长促进 十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基 抑制 金黄色葡萄球菌的检测 甘露醇氯化钠琼脂培养基 生长促进+指示
抑制
绿脓杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 生孢梭菌 生孢梭菌 梭状芽孢杆菌的检测 梭状芽孢杆菌强化培养基 哥伦比亚琼脂
生长促进 生长促进
白色念珠菌的检测 （沙氏）葡萄糖肉汤培养基 生长促进 白色念珠菌 （沙氏）葡萄糖琼脂培养基 生长促进+指示 白色念珠菌
对生长促进性能的检测，液体培养基—用少量（不多于100cfu）适当的微生物，接种部分适合的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不多于检测中规定的最短时间。发生了清晰可见的微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。
对生长促进性能的检测，固体培养基—执行表面铺展法（见非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的平板计数法），用少量（不超过100cfu）适当的微生物给每个平皿接种。在指定的温度下培养，且时间不超过测试中规定的最短时间。发生了微生物生长，且与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。
对抑菌性能的检测，液体或固体培养基—用至少100cfu适合的微生物接种合适的培养基。在指定的温度下进行培养，且时间不少于检测中规定的最长时间。应没有发生供试微生物的生长。
对指示性能的测试—执行表面铺展法（见非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的平板计数法），用少量（不多于100cfu）的适当的微生物给每个平皿接种。在指定温度下进行培养，且时间为在检测中规定的时间范围内。菌落在外观和指示反应上与从此前已检测并批准的培养基批次所获得的菌落是相当的。
检查方法的适用性
按照在供试品的检测项下相关的段落里的描述，对每种新供试品进行样品制备。混合的时候，在指定的增长培养基里加入每种供试菌株。单独接种供试菌株。在被接种的供试制备品中，使用数量相当于不多于100cfu的微生物。 按照在供试品的检测项下相关段落里的描述，使用所规定的最短接种时间进行检测。
规定的微生物必须按照在供试品的检测项下的描述，以指示反应进行检测。 产品的任何抗菌活性会使修改检测规程（见在非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的抗菌活性的中和/去除项）成为必要。
对某个特定的供试品，如果其对于检测所指定的微生物的抗菌活性不能被中和，则可以假定为在供试品中不会存在此种被抑制微生物。
产品的检测
胆汁耐性革兰氏阴性菌
样品的制备和预培养—按照非无菌产品生物学检测：微生物计数检查法<61>章节
中的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，但是使用大豆酪蛋白消化物肉汤培养基作为所选择的稀释剂，混匀，并在20o至25 o时培养一段时间，此时间段足以使细菌复苏但不足以促进微生物的繁殖（通常2个小时而不超过5小时）。
确认微生物不存在的检测—除非另有规定，否则使用按样品的制备和预培养项下规定制备的、对应的1克该产品的制备品，接种至肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30o至35 o下培养24至48小时。再次培养紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基平皿上。在温度30 o至35 o下培养18至24小时。 如果没有菌落生长，则供试品符合该检测的要求。
定量检测—
选择和再培养—将在样品的制备和预培养项下规定的制备品和/或分别包含0.1克，0.01克，和0.001克（或0.1毫升，0.01毫升，和0.001毫升）该供试品的稀释液，接种于适量的肠道菌增菌肉汤培养基。在温度30o至35 o下培养24至48小时。在紫红色胆汁葡萄琼脂培养基的平皿上对培养物进行再次培养。在温度30 o至35 o下培养18至24小时。 说明—菌落的生长构成了阳性结果。记录产生阳性结果的最少量供试品和产生阴性结果的最大量供试品。从表2中大概确定细菌的数量。
表2. 结果的说明
每克或每毫升供试品的细菌几率
每个供试品数量的结果 数量
0.1 g or 0.01 g or 0.001 g or 0.1 mL 0.01 mL 0.001 mL + + + 超过103 + + - 小于103并且大于102 + - - 小于102并且大于10 - - - 小于10
大肠杆菌
样品的制备和预培养—按在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照检查方法的适用性项下的内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀，并在温度30o至35 o下培养18至24小时。
选择和再次培养—摇动容器，转移1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至100毫升的麦康凯肉汤培养基，并在温度42 o至44 o下培养24至48小时。在温度30o至35o下，于麦康凯琼脂培养基的平皿上再次培养18至72小时。
沙门氏杆菌
样品的制备和预培养—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述制备供试品，并使用对应不少于10克或10毫升的数量接种于适量（按照检查方法的适用性项下内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混合，在温度30 o至35 o下培养18至24小时。
选择和再次培养—转移0.1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至10毫升氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基，并在温度30o至35o之间培养18至24小时。在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基的平皿内再次培养。在温度30 o至35 o之间培养18至48小时。
说明—可能存在的沙门氏菌通过生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心来识别。这由鉴定试验来确认。
如果所描述类型的菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。
绿脓杆菌
样品的制备和预培养—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照检查方法的适用性项下描述来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀。当检测贴剂时，通过无菌膜过滤器来过滤对应一贴制备品的样品（见 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中样品的制备项下贴剂），并置于100毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基。在温度30o至35 o之间培养18至48小时。
选择和再次培养—在十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的平皿内再次培养，并在温度30o至35 o之间培养18至72小时。
说明—菌落的生长表明了绿脓杆菌存在的可能性。这需通过鉴别检测来证明。 如果菌落不存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。
金黄色葡萄球菌
样品的制备和预培养—按照 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量来接种适量（按照检查方法的适用性项下的描述来确定）于大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，并使其均匀。当检测贴剂时，通过无菌膜过滤器来过滤对应一贴制备品的样品（见在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节里的样品的制备项下的贴剂），并置于100毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基内。在温度30o至35o度下培养18至24小时。
选择和再培养—再次培养在甘露醇氯化钠琼脂培养基的平皿上，并在温度30o至35o之间培养18至72小时。
说明—金黄色葡萄球菌存在的可能性通过由黄色区域环绕的黄色或白色菌落的生长来识别。这需通过鉴别检测来证实。
如果所描述类型的菌落存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。
梭状芽孢杆菌
.
样品的制备及热处理—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述制备供试品。取对应不少于1克或1毫升供试品的两个等份。将其中一份在温度80o加热10分钟，并快速冷却。不要加热另外一份。
选择和再培养—转移每一个混合部分的10毫升容量相当于检测样品1g或1 ml至两个容器内或其它装有100毫升梭状芽孢杆菌强化培养基 的容器内。在无氧的条件下、温度30o至35o之间，培养48小时。培养之后，将来自每个试管的培养物在哥伦比亚琼脂培养基上进行再次培养，并在无氧条件下、温度30o至35o之间，培养48小时至72小时。 说明—杆菌（带有或没有内生孢子）厌氧性生长出现阴性过氧化氢酶反应的现象，表明了梭状芽孢杆菌的存在。
用确证试验进行证实，如果所描述的菌落类型不存在或者证实试验是阴性，则供试品符合该检测的要求。
白色念珠菌
样品的制备和预培养—按照在 非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述制备供试品，并使用10毫升或对应不少于1克或1毫升的数量，接种于100毫升（沙氏）葡萄糖肉汤培养基，并混匀。在温度30o至35o之间培养3至5天。
选择和再培养—对在（沙氏）葡萄糖琼脂培养基的平皿中进行再次培养，并且在温度30o至 35o之间培养24至48小时。
说明—白色菌落的生长可以表明白色念珠菌的存在。这需通过鉴别检测来证明。
如果这样的菌落不存在或者如果确认鉴别检测为阴性，则供试品符合该检测的要求。
建议的溶液和培养基
[注—给出本节以提供资料。
以下溶液和培养基已经证实能够令人满意地用于其用途，正是为了此用途它们被置于药典的微生物污染检测项下。其他培养基可能成为药典中的微生物污染。如果其他培养基具有相应的符合性则也可以使用。
贮备缓冲溶液—将34克磷酸二氢钾转移到一只1000毫升容量瓶内，溶解在500毫升纯净水中，以氢氧化钠调整pH值为7.2±0.2，加入纯净水至刻度，并混匀。
oo
分装在容器中，并灭菌。在温度2到8之间贮存。
磷酸盐缓冲液pH值7.2—制备纯净水与贮备缓冲溶液（800:1 v/v）的混合液，并灭菌。
缓冲氯化钠－蛋白胨溶液pH值7.0
磷酸二氢钾 3.6 g 二水合磷酸氢二钠 7.2 g (相当于0.067M磷酸盐) 氯化钠 4.3 g
蛋白胨（肉类或酪） 1.0 g 纯净水 1000 mL
在一个高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
大豆－酪蛋白消化物肉汤培养基
酪蛋白胰酶消化物 17.0 g 大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0 g 氯化钠 5.0 g 二元磷酸氢盐 2.5 g 水合葡萄糖 2.5 g 纯净水 1000 mL
调整pH的值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器以经过验证的周期进行灭菌。
大豆－酪蛋白消化物琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物 15.0 g 大豆木瓜蛋白酶消化物 5.0 g 氯化钠 5.0 g Agar 琼脂 15.0 g Purified Water 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
(沙氏)葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖 40.0 g 动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物混合10.0 g 物（1:1） 琼脂 15.0 g 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为5.6±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基
马铃薯浸液 200 g 葡萄糖 20.0 g 琼脂 15.0 g 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为5.6±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
(沙氏)葡萄糖肉汤培养基
葡萄糖 20.0 g 动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物混合10.0 g 物（1:1） 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为5.6±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
肠道菌增菌肉汤培养基
白明胶胰酶消化物 10.0 g 水合葡萄糖 5.0 g 脱水牛胆汁 20.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 二水合磷酸氢二钠 8.0 g 亮绿 15 mg 纯净水 1000 mL
o
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25时，pH值为7.2±0.2。加热到100 o持续30分钟，立即冷却。
紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基
酵母提取物 3.0 g 白明胶胰酶消化物 7.0 g 胆盐 1.5 g 氯化钠 5.0 g 水合葡萄糖 10.0 g 琼脂 15.0 g 中性红 30 mg 结晶紫 2 mg 纯净水 1000 mL
o
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25时，pH值为7.4±0.2。加热至沸腾；不得在高压灭菌器内加热。
麦康凯肉汤培养基
白明胶胰酶消化物 20.0 g 一水乳糖 10.0 g 脱水牛胆汁 5.0 g 溴甲酚紫 10 mg 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
麦康凯琼脂培养基
白明胶胰酶消化物 17.0 g
蛋白胨（肉类和酪蛋白） 3.0 g 一水乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 胆盐 1.5 g 琼脂 13.5 g 中性红 30.0 mg 结晶紫 1 mg 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在灭菌后，温度为25o时，pH值为7.1±0.2。沸腾1分钟并且持续摇动，然后在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基
大豆蛋白胨 4.5 g 六水氯化镁 29.0 g 氯化钠 8.0 g 磷酸氢二钾 0.4 g 磷酸二氢钾 0.6 g 孔雀石绿 0.036 g 纯净水 1000 mL
轻微加热，溶解。在时，使用高压灭菌器，温度不超过115 o，以经过验证的周期进行灭菌。在加热和高压灭菌后，温度25o时，pH值为5.2±0.2。
r木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基
木糖 3.5 g L-赖氨酸 5.0 g 一水乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 氯化钠 5.0 g 酵母提取物 3.0 g 酚红 80 mg 琼脂 13.5 g 脱氧胆酸钠 2.5 g 硫代硫酸钠 6.8 g 枸橼酸铁铵 0.8 g 纯净水 1000 mL
调整pH值，以使在加热后，温度为25o时，pH值为7.4±0.2。加热至沸腾，冷却到50o，并倒进培养皿内。不得在高压灭菌器内加热。
十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基
白明胶胰酶消化物 20.0 g 氯化镁 1.4 g 硫酸二钾 10.0 g
十六烷三甲基溴化铵 0.3 g 琼脂 13.6 g 纯净水 1000 mL 甘油 10.0 mL
加热伴以摇动至沸腾1分钟。调整pH值，以使在灭菌后，温度为25 o时，pH值为7.2±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
甘露醇氯化钠琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物 5.0 g 酪蛋白胃蛋白酶消化物 5.0 g 牛肉浸膏 1.0 g D-甘露醇 10.0 g 氯化钠 75.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.025 g 纯净水 1000 mL
加热伴以摇动至沸腾1分钟。调整pH值，以使在灭菌后，温度为25 o时，pH值为7.4±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
梭状芽孢杆菌强化培养基
牛肉浸膏 10.0 g
蛋白胨 10.0 g 酵母提取物 3.0 g 可溶性淀粉 1.0 g 一水葡萄糖 5.0 g 半胱氨酸盐酸盐 0.5 g 氯化钠 5.0 g 乙酸钠 3.0 g 琼脂 0.5 g 纯净水 1000 mL
将琼脂水合，并加热伴以持续搅拌直至沸腾使其溶解。如果有必要，调整pH值，以使在灭菌后，温度为25 o时，pH值大约为6.8±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。
哥伦比亚琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物 10.0 g 肉类胃酶消化物 5.0 g 心脏胰酶消化 3.0 g 酵母提取物 5.0 g 玉米淀粉 1.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂，根据其凝胶化机能调节数量 10.0-15.0 g
纯净水 1000 mL
将琼脂水合，并加热伴以持续搅拌直至沸腾使其溶解。如有必要，调整pH值，以使在灭菌后，温度为25 o时，pH值为7.3±0.2。在高压灭菌器内以经过验证的周期进行灭菌。静置冷却到温度为45o至50 o之间；如需要，加入对应20 mg庆大霉素盐基的硫酸庆大霉素，并倒进培养皿内。
(Official May 1, 2009/2009年5月1日生效)
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