DNA芯片技术是在分子生物学与微电子学基础上发展起来的一种高新技术，具有重要的理论意义和广泛的应用前景。
本章重点讨论：DNA chips技术的基本概念；基本原理与方法及其应用。
第一节 概述
一、 DNA chips技术的基本概念
DNA chips技术：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA probe以显微打印的方式有序地固定在支持物表面上，然后与标记的样品进行杂交，通过对杂交信号进行检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达信息）。
DNA chips=gene chips=DNA array DNA chips：检测Nc与Pr Biochips protein chips：检测Pr 其它芯片 样品制备芯片 核酸扩增芯片 毛细管电泳芯片 广义Biochips:
还包括缩微芯片实验室（laboratory on a chip, microlab）。 二、 DNA chips的主要类型
按其制备的方式不同分为两类
1．原位合成芯片（synthetic gene chip）：应用显微光蚀刻（photolithograpy）技术，在芯片的特定部位合成寡核苷酸而制成的芯片。 优点： 集成度高，10—40万点阵/ cm2。
缺点： Probe长度较短，<50Nt。
2．DNA微集阵列（DNA microarray）：将预先制备的DNA Probe，以显微打印的方式有序的固定在固相支持物的表面上而制成的。又称DNA微集芯片（microchips）。
优点：探针组来源灵活，合成的Probe长，可达500Nt。 缺点：集成度较低，1—10万点阵/cm2。
第二节 DNA芯片技术的基本原理与方法
主要包括四个方面： 一、 芯片的制备 实性材料 （一） 支持物
膜性材料：聚丙烯膜，尼龙膜，硝酸纤维素膜
实性材料表面要引入活性基因（如—OH，—NH2），并用光敏保护基团进行保护，引入的基团能与活化的Nt或者DNA中的基团形成共价键，结合于支持物的表面。膜性材料要包被氨基硅烷或polylys（多聚赖氨酸），使其带上正电荷以吸附带负电荷的DNA Probe。 （二）原位合成芯片的制备 制备技术有两种：
1．显微光蚀刻（photolithography）技术 合成时，不需要聚合的部位用光刻掩膜进行保护，需要聚合的部位由于无掩膜，经激光点光源照射后，光敏保护基团被去除，其活性基团就可以与加入的经亚磷酰胺活化的Nt发生共价偶联，该Nt的另一端用光敏保护基团X保护，以便下一个Nt的延伸：然后更换掩膜，使支持物上的其它部位分别去保护，依次偶联上
其它的Nt，完成第一循环，共4步反应（每加一个Nt为一步反应）。
图： 光刻掩膜（mask）
X X X X 光敏保护基团 X X X T—X X X X X 去保护基团 T X X X X 掩膜保护 T 重复 X X X X T G C A ，完成了第一循环；然后按上述步骤依次进行反应， 逐个接上不同的Nt，直至合成所需长度的寡核苷酸。
优点：合成速度快，步骤少，Probe数目量n次方增加。例如：八聚
核苷酸，经4×8=32步反应，不到8h，可合成48=65536个不同序列的Probe。
缺点：产率低，每步反应产率为95%，合成30Nt的寡核苷酸，产率
仅为20%，合成的Probe较短。若去保护不彻底，会使杂交信号模糊，信噪比低。
2．压电打印（piezoelectric printing）技术 是喷墨打印技术的一种，其核 心组件是一个压电毛细管喷射器；其上端装有储液囊，中端有一个压电感 应元件，通过压电感应装置的舒缩，控制液滴的喷射与否。
图：
如此完成第一个循环，然后固定、洗脱、去保护；再继续进行寡核苷酸延 伸的下一个循环，直至合成所需长度的寡核苷酸。
优点：合成的Probe长，可达40—50Nt；产率高，30Nt可达74%。
（三）DNA微集阵列的制备
先制备Probe，然后再打印在芯片上。 1．Probe的制备
1）已克隆的基因片段；2）PCR扩增的基因片段；3）人工合成的DNA片段（基因片段）。Probe可以是寡核苷酸片段；DNA或基因组中的基因片段，可以是双链也可以是单链的DNA或RNA片段；也可以用肽核酸作为Probe。 2．打印 有喷墨打印和针式打印两种方式。
1）喷墨打印：应用喷墨打印工业的技术制备DNA微集阵列，其原理与压电打印法基本相同。即将合成的DNA Probe置于滴定盘中，用打印头从滴定盘中吸取探针试剂，然后用热敏式或声控式喷射器的动力把液体喷射到支持物上。
优点：①打印速度快；②液滴定量准确，重现性好，使用寿命长；③喷送
液体不受支持物的影响；④无来自支持物表面的污染；⑤对易破碎的支持物表面无损害，尤其适用于膜性支持物。
缺点：斑点大，探针密度低，易受DNA浓度的影响，导致液体分配不均。 2）针式打印：通过不锈钢打印针与支持物的接触来完成液体转移的一种方 式，故又称点样法。通过接触留下液体，然后将打印针洗净干燥后，再 进行下一个位点的打印；也可以多针同时打印。
优点：①操作简单，成本低；②打印液滴小，探针密度高；③探针液损
失少。
缺点：定量准确性及重显性差；打印针易阻塞且使用寿命短。 3．Probe的固定
固定探针，封闭支持物上未打印的区域。固定探针可用紫外线照射，使探针中的胸腺嘧啶（T）与支持物上带正电荷的—NH2形成共价键而固定。 二、 样品的制备
首先从组织细胞中提取DNA或mRNA，加以纯化；然后将纯化的核 酸加以扩增，扩增时可采用固相的PCR系统。
样品标记目前主要采用荧光素标记法，也可采用同位素和生物素进行标记，但较少用。样品标记在PCR或RT-PCR过程中进行。常用荧光素或生物素标记dNTP，若用生物素标记，还需要用链霉亲合素—荧光素引导进一步检测。待测样品和正常对照可采作双色荧光标记。 三、 分子杂交
上述制备的样品即可与DNA芯片进行杂交。DNA芯片上的杂交与经 典的分子杂交不同，经典的分子杂交所需时间长（4—24h），固定的是样品，标记的是Probe，故检测的样品少；而DNA芯片杂交所需时间短（30min），固定的是Probe，标记的是样品，这种杂交可使检测过程平行化，检测样品可以成千上万。由于集成显微化，所需Probe和样品量均大为减少。
目前已开发的电子基因芯片可显著提高杂交的速度，可在1min到几秒内完成。
肽核酸（peptide nucleic acid , PNA）也可作为Probe，以消除DNA二级结构对杂交的影响，使杂交的稳定性及特异性显著提高，可用于单碱基突变基因的检测。 四、 检测分析
用激光扫描仪或激光共聚焦显微镜检测杂交点荧光的位置和强度；用 相关软件进行图像分析和数据处理，并与Probe阵列位点进行比较，即可得到待测样品的信息。荧光法检测的优点：重复性好；缺点：灵敏度差。
目前正在研究开发灵敏度高的，更快速的检测方法，如质谱法、化学发光法、光导纤维法、生物传感器法等以代替荧光法。
第三节 DNA芯片技术的应用
DNA芯片技术是一种能对大量生物样品进行平行、快速、灵敏、高 效的基因分析的方法，应用广泛。
一、 DNA测序——杂交测序法（sequencing by hybridization） 将待测基因
序列与DNA芯片上大量的固化探针进行杂交，产生杂交图谱，然后排列出基因序列。例如：12Nt待测序列与原位合成的8Nt阵列上的Probe进行杂交，有5个Probe产生荧光信号，其5个Probe序列分别是：
T C G G A T C G C G G A T C G
G G A T C G G A T C G A T C G
∴ T C G G A T C G 待测DNA序列是：AGCCTAGCTGAA
8Nt阵列可测200个Nt序列，12Nt阵列可测1000个Nt序列。 二、 基因表达分析
利用基因芯片可以平行、自动化检测大量基因的表达；理论上在一张 芯片上通过一次杂交反应可以检测人基因组所有基因表达与否及表达的丰度。两种相关的细胞的表达情况可同时在一张芯片上显示出来，以便比较二者的微细差异，已用于蛋白质组研究。 三、 基因组研究
基因组研究的主要内容包括：作图、测序、基因鉴定和基因功能分析。 DNA芯片技术正被广泛的应用在基因组的研究中。 四、 基因诊断
DNA芯片技术可以检测内源性基因的变异和外源性基因的入侵，也 可检测基因表达是否异常，现已用于许多病的基因诊断。 五、 药物研究与开发
主要用于药物的筛选、新药发现、合理用药及真假药物的辨别。 六、 其它领域
可用于人口健康普查、优生、法医鉴定；在工、农、林业及食品与环 境监测等方面也具有极大的潜力。
第十五章 癌基因与抑癌基因
肿瘤的发生与细胞的增殖、分化异常有关；正常细胞的增殖与分化受到严格地调控。原癌基因（Proto-oncogene）：与细胞增殖的正调控有关，其作用是促进细胞增殖，抑制细胞的分化，具有潜在致癌能力的基因；抑癌基因（suppressor gene）：与细胞增殖的负调控有关，抑制细胞增殖，促进分化，抑制肿瘤形成的基因。当原癌基因与抑癌基因发生突变而表达异常时，便可导致细胞增殖失控而产生肿瘤。
第一节
一、 癌基因（oncogene）
癌基因与抑癌基因
能够促进细胞转化的基因；又分为病毒癌基因（v-onc）和细胞癌基因（c-onc）。
（一） 病毒癌基因和细胞癌基因
v-onc：病毒所携带的致转化基因。现已发现了几十种v-onc，其命名一般用3个斜体小写字母来表示，如myc、ras、fos等。
c-onc：正常细胞中的具有潜在致癌能力的基因，又称 癌基因，以与被激活的癌基因相区别。现已发现c-onc有近百种。特点？
v-onc与c-onc二者结构与产物相似，其序列也具有一定的同源性。但二者也有区别，其区别是：
1．病毒癌基因通常丢失了两端的某些序列。
2．v-onc无Intron；而c-onc外显子保守，例如人和鼠src基因产物的Mw 均为60KD，脊椎动物中所含的3个c-ras(H.K.N)基因产物的Mw均为 21KD（P21蛋白）。
3．v-onc与c-onc二者的编码序列也有微小差别。例如v-H-ras与人c-H-ras 基因所编码的Pr中的189Aa残基中有3个Aa残基不同；v-K-ras 与人 c-K-ras基因编码的Pr中有7个残基不同，这些差别决定了它们的转化性质。
4．v-onc易发生碱基取代或缺失等突变，而c-onc少见。 （二）癌基因家族
根据癌基因的结构与功能特点可归为6个这族。
1．Src癌基因家族：包括src、abl、fes、yes等，它们均含有相似的基因编
码结构，其产物具有TPK活性及与膜结合的特性。
2. ras家族：包括H、K、N-ras三种，其表达的ras 蛋白（P21）是一个信
息传递分子，具有GTP酶活力。
3．myc家族：C、L、N-myc、fos等，其序列同源性很高，但编码Pr的Aa序列差别大。其表达产物为核内DNA结合蛋白或反式作用因子。 4．sis家族：只有sis一个成员，其表达产物P28蛋白与人血小板源生长因子（PDGF）β链结构相同。
5．erb 家族：包括erbA、erbB、mas等，其表达产物是细胞骨架蛋白。如erbB表达产物是EGFR。
6．Myb家族：包括myb和myb-ets复合体基因。编码核蛋白，能与DNA结合，为核内的一种转录调节因子。 二、抑癌基因 作用及鉴定？
当抑癌基因发生变异而失活时，就可使正常细胞转化为肿瘤细胞。 抑癌基因和癌基因在细胞增殖和分化的调控中同等重要，二者有拮搞 作用。
抑癌基因的表达产物主要包括膜受体，胞质中的调节因子，转录因子 及转录调节因子，细胞周期因子，DNA操作修复因子等。抑癌基因见表15-1 （P228）。
第二节 癌基因与抑癌基因在细胞增殖调控中的作用
一、 癌基因表达产物在细胞增殖信号转导中的作用
正常细胞的增殖需要增殖信号，再经信号转导途径传入胞内，再通过
反式作用因子的作用，使多种与细胞增殖有关的基因表达，从而使细胞进入增殖状态。癌基因的表达产物对细胞增殖的调控有重要作用。 癌基因的表达产物主要分六类：
1．生长因子（GF）类 int-2表达产物是成纤维细胞生长因子（FGF）； sis编码产物与PDGE的β链同源，其同源性可达87%，可与PDGE受体结合，对细胞增殖与分化起调控作用。 2．受体类
1）TPK的跨膜生长因子受体：如erbB表达产物为EGF受体；c-fms其表达产物是CSF受体。
2）可溶性TPK受体：如met、trk。
3）非蛋白激酶受体：erbA的表达产物为甲状腺素受体；mas的表达产物为血管紧张受体。
3．低分子量G蛋白（P21蛋白）：H、K、N-ras的表达产物。 4. 胞内蛋白激酶
1）与膜结合的TPK：src家族的表达产物，催化底物酶的Tyr残基磷酸化，以活性形式结合于细胞膜内侧，这一变化与癌细胞的无限生长有关。 2）胞浆中ser/Thr蛋白激酶：raf、cot、mos等。
5．胞浆调节蛋白：crk的产物是胞浆中的一种调节蛋白，其作用机制尚不清。 6．核内转录因子
许多癌基因表达产物本身就是反式作用因子。如C、L、N-myc、myb、fos等，是生长信号传递途径的终未分子。
二、癌基因与抑癌基因在细胞周期调控中的作用。 （一） 细胞周期与调控机制 G1期
间期 S期 前期 细胞周期 G2期 中期 有徐分裂期（M期） 后期 末期 图 G1/S转折点（G1检测点） 细胞周期调控点 G2/M转折点（G2检测点） 是否启动（驱动机制） 细胞周期调控关键
能否忠实运行（监控机制） 细胞周期素（cyclin） 细胞周期调控因素
细胞周期素依赖的激酶（cdk） 调控机制：
P
（+）（+）G1期：生长因子 cyclinD↑d cdk2.4.5活化 cyclinEg表达
促进细胞通过G1/X 限制点进入S期。 此时cyclinD.E降解。
cdK2活化 P
cdK2—cyclinE
在S期：cyclinA表达合成 cylinA-cdK2 cdK2活化
DNA合成
促进与DNA复制 有关的基因表达
E2F（转录因子）活化机理 Rb蛋白 cylinA-cdK2
E2F Rb蛋白 无活力 G2期：
E2F（有活力）
P P （+）
E2F活化
cyclinB与核内 Thr14
cyclinB表达 cdc2结合 cyclinB-cd Tyr15 即：cyclinB-cdc2 Thr161 （活化） cdc：cell division cycle control factor G2/M转折点 也是一种蛋白激酶 M期 M期：
活化的
核纤层蛋白磷酸化 核纤层蛋白解骤 核膜解体 cyclinB-cdc2 染色质蛋白磷酸化 染色质聚合，形成染色体。 微管结合蛋白磷酸化 纺缍形成。
P 完成M期后，cyclinA、B降解，又使细胞处于G0或G1期，完成了一个细胞周期。
（二） 原癌基因在细胞周期调控中的作用
受体型TPK-ras-MAPK跨膜信息传导途径中包括Grb2、sos、Ras、Raf、MAPK、MAPKK及MAPKKK。
若MAPK磷酸化促进cyclin表达；抑制其降解；使细胞停上M期。负性生长因子如TGFB可抑制cdK4和cyclinE的表达，使cyclinD-cdK4及cyclinE-cdK2降解，使细胞停留在G1期。
1）有的原癌基因产物本身就是cyclin。如PraD1表达产物就是cyclinD1。 2）有的原癌基因表达产物可诱导cyclin的表达。如c-myc产物适量可诱导cyclinD1的表达，但过量可抑制其表达；c-myc对cyclin调节是双向的。 3）有的原癌基因产物是cyclinB-cdc2激酶的底物，或本身就有TPK活力。 例如：c-abl、src等表达产物均为cyclinB-cdc2的底物；Abl蛋白被磷酸化失去DNA结合能力，src蛋白被磷酸化增加其激酶活力。 在G1期： Abl蛋白
RB蛋白 RB蛋白
P
无TPK活力 Abl蛋白有TPK活力， 加强ras途径
4）有的癌基因V-erbB、V-erbB2、neu、V-src等。表达产物均具有PK活力， 可加强TPK-ras-MAPK跨膜信息的传递，而促进G1期→S期。 三、 抑癌基因在细胞周期中的调控作用
抑癌基因可抑制细胞周期停止于静止期，并使复制不完全或受损 DNA不能进入M期，以防止细胞癌变。几种抑癌基因的作用机制如下：
1．Rb基因在细胞周期调控中的作用
Rb基因（retinoblastoma gene）位于13q14，含237个外显子，可转录出4.7kb的mRNA，编码蛋白的Mw为105KD（P105，RB蛋白），定位于核内，有磷酸化和非磷酸化两种形式，非磷酸化为活性形式，具有抑制细胞增殖，促进细胞分化的作用。
实验表明在静止期（G0、G1期），RB蛋白磷酸化程度低，而在S期其磷酸化程度高，说明RB蛋白磷酸化／脱磷酸化对细胞增殖与分化起重要调控作用。
１）RB蛋白对细胞周期的调节作用：RB蛋白抑制G1期，从而抑制了细胞
周期；RB蛋白可被cyclin(D.E.A)-cdK(2.4)磷酸化而失活，从而使细胞逐步通过细胞周期控制点。RB蛋白降解发生在M后期。 2）RB蛋白对转录因子E2F的调节作用：一抑制E2F活力。 RB蛋白
cyclin(D.E.A)-cdK(2.4)
P
E2F RB蛋白 无活力 E2F有活力 促进许多参与S期
的酶和Pr表达
若病毒癌蛋白（如SV40-T蛋白、乳头瘤病毒E7蛋白、腺病毒EIA蛋白）与RB蛋白结合。RB便失去抑制E2F的功能，这样就促进了细胞的增殖。值得一提的是：E2F促进Rb基因的表达，过量表达的RB蛋白又反馈抑制E2F的功能，这种RB/E2F反馈调节机制对细胞周期的稳定具有重要意义。 3）RB蛋白对cyclinD1的调节作用：RB蛋白与cyclinD1上的RB结合部位 LXCXE结合后，使RB蛋白磷酸化而失活，使细胞周期摆脱RB蛋白的
抑制，进入S期；同时RB蛋白的磷酸化又反馈抑制cyclinD1的表达，这种反馈调节对细胞周期的稳定也有重要意义。 2．P53基因在细胞周期调控中的作用
人P53基因约20kb，位于17P13，转录2.5kb的mRNA，表达产物的Mw约为53KD蛋白（P53），P53蛋白含三个结构区，共393Aa残基组成。
①酸性区：N端1-80位Aa残基组成，易被蛋白酶水解，半寿期短（10min）与此有关；含有特殊的磷酸化位点，具有促进转录的作用。
②核心区：富含Pro的非极性区，由102-290位Aa残基组成，进化上高度保守，功能上十分重要，具有特异的DNA结合能力。
③碱性区：位于C端的319-393位Aa残基组成，P53蛋白通过这一区域可形成四聚体，C端可单独具备转化活性，起癌基因作用；有多个磷酸化位点（如cdk磷酸化位点），被多种蛋白激酶所识别。
P53抑制细胞的增殖，促进细胞的制凋亡，其作用是多方面的： 1）抑制cyclinA，抑制了细胞周期（停止于G1期）。
2）抑制DNA复制，当DNA损伤后，即结合于损伤部位，阻止DNApol与DNA起始复合物的结合。
3）激活某些抑制细胞分裂的基因的表达，间接抑制细胞的增殖。 4）抑制某些癌基因产物（如c-myc、ras基因产物）和腺病毒EIA蛋白对细胞的转化作用。
5）当DNA损伤太严重，修复功能难以承受时，P53就促进细胞凋亡（apoptosis），从而防止了细胞的恶变。 3．基因（肾母细胞瘤基因）
遗传Wilms瘤中分离的WT1基因位于11P13；而散发性Wilms瘤中分离的WT1基因位于11P15。WT1基因表达产物的Mw为50KD，含4个锌指结构，为DNA结合蛋白，其功能是促进细胞的分化，故为一个抑癌基因。WT1蛋白中的4个锌4指结构与EGR-1（early growth response factor-1）所含有的3个锌指结构相似，都能与DNA上的特异序列（5＇—CGCCCCGC—3＇）特异性结合；但其作用却相反，EGR-1促进其下游序列的转录，而WT1蛋白则阻抑其转录。这种作用可能与WT1蛋白N端富含Glu和Pro残基有关；若将WT1基因5＇端编码富含Glu和Pro的序列连接到编码EGR-1的锌指结构的5＇端，可导致EGR-1也成为一个转录阻抑剂。由于WT1蛋白是一个转录阻抑剂，若其基因空变，则功能丧失，就可引起细胞恶变。
第三节
一、 原癌基因激活的机制
癌基因和抑癌基因与肿瘤的发生
（一） 原癌基因点突变（point mutation）：点突变是指基因的某一位点的个
别碱基发生变异，主要是指碱基夫换，也可以是个别碱基的插入或缺失，尤其是密码子第一、二位碱基的突变，往往会导致Aa的替换。Pr分子中关键Aa的替换会导致构象和功能改变。原癌基因的表达产物具有促进细胞增殖功能，充当细胞生长因子、生长因子受体、增殖信号转导因子及转录调节因子的作用。当原癌基因发生点突变，使其表达产物构象与功能发生改变时，对细胞增殖的刺激增强；也可以对Pr本身的稳定性增加，导致该Pr在细胞内的浓度↑，对细胞增殖刺激的时间和强度也增加。
Ras基因家族（H.K.N-ras）的激活均以点突变为主，最觉的突变发生在12位密码子（Gly12→val12）其次为13.59.61位密码子。致癌剂如亚硝酸盐诱发的食道癌细胞中，H-ras发生点突变使12位密码子GGC为变GAC，结果使其P21蛋白中的Gly被ASP替代。 （二） 启动子或增强子插入：某些不含v-onc的逆转录病毒，其前病毒DNA
插入到细胞染色体中，引起插入突变。插入前病毒DNA两端各有一个相同的长末端重复序列（LTR），它们不含编码蛋白，而含有启动子、增强子。若插入原癌基因附近位置，则可活化原癌基因并启动和增强癌基因的表达。例如鸟类白血病病毒ALV并不含v-onc，但ALV前病毒插入c-myc基因上游，其右侧LTR所含的强启动子致使myc基因活化。c-myc基因还会因获得下游远端的增强子而被激活，例如前病毒插入到c-myc基因下游不能作为启动子活化c-myc，而是作为增强子活化上游c-myc基因的表达。
（三） 甲基化程度降低：DNA分子中的甲基化对于保持双螺旋结构的稳
定，抑制基因的转录有重要作用。某些原癌基因的甲基化程度降低被激活。例如结肠癌和小细胞肺癌中c-ras基因的甲基化程度明显降低。
（四） 基因扩增（gene amplification）：原癌基因的扩增，可使其表达产物
量增加，使正常细胞的功能紊乱而引起癌变。例如急性粒细胞白血病有c-myc基因的大量扩增；人视网膜母细胞瘤、原发性神经母细胞瘤、小细胞肺癌均有c-myc的大量扩增；小鼠胸腺瘤中发现C-N-ras的扩增。
（五） 基因易位或重排：在许多肿瘤中均可见到染色体异常，通过基因分
步定位（gene walking）研究已证明在这些异常的染色体中某些部位发生了基因易位和重排。例如：Burkitt 淋巴瘤中有（2；8）、（8；14）、（8；22）多种染色体易位；早幼粒细胞白血病者有（15；17）染色体易位等。
基因易位可使原来无活性的原癌基因转移到某些强启动子或增强子 附近而被激活，从而使原癌基因产物量显著增加，而导致肿瘤发生。例如人Burkitt 淋巴瘤细胞中，位于8号染色体上的c-myc基因移位到14号染色体Ig重链基因的调节区附近，与该区的强启动子连接而激活。
在前五种原癌基因激活机制中，第一种是由于基因的点突变而导致表达产物结构变异而引起细胞的癌变；后四种激活机制只涉及转录、表达增强，使癌蛋白数量上的增加导致细胞的癌变，而无原癌基因结构的变异。
二、原癌基因激活与肿瘤的发生 （一）肿瘤发生学说——多阶段学说
正常细胞中的原癌基因在某些理化及生物因素等致癌因子作用下，经过启动阶段，促癌阶段和演进阶段方可转化为癌细胞，此为肿瘤发生的多阶段学说。
1．启动阶段（initiating stage）：在启动因子作用下，细胞中的DNA已发生改变，便细胞的表型仍属正常。
启动因子（initiator）：指在癌变的启动阶段使细胞发生癌前期改变的因素。具有致癌作用，均属癌剂。与DNA共价键结合，不可逆。干细胞及处
于分裂增殖期的细胞较处于相对静止状态的细胞对启动因子敏感。 2．促癌阶段（promoting stage）：由癌前期细胞转变为癌细胞的阶段。此时
在启动因子与促癌因子协同作用，使细胞表型改变，表现癌细胞的多3。种恶性表型。促癌因子与启动因子不同，其主要区别见表15-2（P235）。 3．演进阶段（Progressing stage）：是细胞恶变的巩固和终末阶段，即少数 恶变细胞能自主分裂繁殖，在促癌阶段所形成的增生病灶的基础上，形成灶连灶（foci with foci），是进一步浸润、转移的基础。 （二）癌基因激活与肿瘤发生：
1．Ras基因变异与肿瘤发生：研究表明：约有10-15%的肿瘤中有ras 基因 的点突变，其中K- ras更易突变。K- ras的突变位点：主要是编码12位Aa残基，少数为13位和61位点突变。ras基因的点突变降低了Ras 蛋白水解GTP的能力，这是因为突变的Ras蛋白降低了自身的GTP酶活力，还降低了与GTP酶活化蛋白结合的能力，结果导致Ras蛋白与GTP持续结合，促进细胞的增殖、生长。
50%的肠癌中有K- ras基因的点突变，其中80%发生在12位密码子，15%发生在13位密码子；在5-10%的腺瘤中均有ras基因的点突变，这可能与腺瘤向癌转化有关。
2．myc基因变异与肿瘤发生：myc癌基因首次在Burkitt淋巴瘤中发现，经染色体易位被激活。常见的易位是8号染色体上的myc基因与14号染色全Ig重链基因融合而被激活。
在某些肿瘤中如小细胞肺癌、上皮癌（乳腺癌、结肠癌），myc基因的激活则是基因扩增的结果，使myc基因持续高表达。Myc的表达产物
在细胞生长调控中有重要作用，myc蛋白与DNA特定序列结合，并与Max蛋白结合形成二聚体而起转录因子的作用，当myc基因高表达时，导致细胞失控性生长。
3．neu基因变异与肿瘤发生：neu基因也称her-z或c-erbB-z基因。neu基因主要通过点突变而激活，其突变导致Neu蛋白跨膜区Aa变异而具有转化活性。利用抗Neu蛋白的抗体可以抑制依赖于neu基因过度表达的瘤细胞的恶性生长。
4．Bcl-z基因与肿瘤发生：该基因是从B淋巴细胞瘤中分离出的癌基因，经染色体易位而激活，18q上的确良bcl-z基因易位到14q上的Ig重链基因位点的强启动子相结合，使bcl-z基因表达失控，而发生恶变。bcl-z表达产物的Mw25KD，位于核膜、内质网及线粒体外膜上，其作用是抑制细胞的凋亡。
5．mdm基因与肿瘤发生：mdm是一个保守基因，定位于12q13-14。其表达产物定位于胞核，该蛋白是由491Aa残基组成含有锌指结构的蛋白质。Mdm蛋白促进癌变的机制之一是：与P53及RB蛋白结合，使P53及RB蛋白功能失活；多种因素如紫外钱照射可诱导Mdm蛋白的过度生成。 三、抑癌基因失活与肿瘤的发生
1．Rb基因：Rb蛋白抑制细胞增殖，促进细胞的分化，通过其碗酸化/脱磷酸化对细胞周期进行调节。Rb基因变异主要是基因缺失和突变，使其表达产物失去正常功能、则细胞不受RB蛋白的负调控，细胞调节失控，使细胞恶变。
2．P53基因：约50%以上的肿瘤与P53基因变异有关，其变异主要有点突变、
缺失、移码突变、基因重排。P53基因的突变大多数为错义突变，少数为无义突变，特别是上皮源性癌；在肉瘤中主要是基因重排及插入突变为主，而错义突变少见。多数突变发生在保守区，其区段分别在132-143，174-179，236-248和272-281。
P53基因不同的突变与致癌因素有关。例如在皮肤癌中均发生于双嘧啶部位，是红外线引起突变的靶位。在原发性肝癌中，若P53基因突变发生第249密码子，可能是黄曲霉素B1作用所致。
P53基因变异的另一种形式是等位基因缺失，在结肠癌、乳腺癌在两个P53等位基因均失活；在原发性肝癌中P53等位基因杂合型缺失频率可达25-60%；在乳腺癌、肺癌中也存在着P53等位基因的杂合型缺失。P53基因的甲基化改变也是常见的基因变异。
P53基因的变异是目前所发现的肿瘤中最常见的遗传改变的，有70%结肠癌、50%的肺癌，30%-40%的乳腺癌中均有P53基因的突变，说明P53基因在抑制肿瘤的发生、发展中起重要作用。
3．P16基因又称多瘤抑制基因，编码cdK4的抑制蛋白，其Mw为15.8KD（P16）；P16蛋白与cylinD竞争与cdK4结合，P16与cdK4结合后抑制其活力，不能使RB蛋白磷酸化，则不能争除RB蛋白对E2F的抑制，故P16蛋白抑制细胞增殖、生长。当P16基因变异而不能正常表达时，可使细胞恶变。
P16基因变异以纯合性基因缺失为主，占70%-80%也可发生点突变但频率较低，不同肿瘤的突变频率不同；同一肿瘤不同的分化程度，其缺失和突变率也不同。P16基因变异高于其它的抑癌基因。P16基因的异常包
括了肿瘤的大部分类型，包括散发性和有遗传倾向的肿瘤。
P16基因的变异，将使细胞周期的驱动机制处在一个易于被启动的状态；导致癌基因产物增多，促进细胞的增殖和恶变。 四、肿瘤发生中的多基因协同作用
细胞癌变的多基因协同学说：细胞癌变是多步骤，多重打击的复杂过 程，在肿瘤发生发展的各阶段，至少需要两个或两个以上不同的癌相关基 因的异常激活或失活，才有可能引起细胞的癌变。这主要是因为细胞的增 殖和分化受多种因素的控制，需要多种癌相关基因的协同作用才能脱离这 些控制。
变异基因之间的协同效应符合一定的规律。例如核内癌基因产物易与 胞浆癌基因产物发生协同效应。核内的Myc蛋白与胞浆中的Ras蛋白发生 协同而使细胞癌变。
在癌变的发生和发展过程中，癌基因的激活和抑癌基因的失活必须同 时存在。例如直肠结肠癌在发生和发展过程中，抑癌基因APC和DCC的 突变、丢失和失活，而且还伴有K-ras癌基因的突变激活。
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