生物学教学２０１７年（第４２卷）第１１期 －３・ ＤＮＡ测序技术概述 付春鹏 （山东省潍坊科技学院２６２７００） 摘要核酸是生命体的基本遗传物质，基因组蕴藏了遗传的奥秘。ＤＮＡ测序可以快速、准确地获取生物体的遗传信息，对于生 命科学研究具有重要意义。迄今，测序技术经历了Ｓａｎｇｅｒ测序法、边合成边测序法、单分子测序和纳米孔测序共４代变革。本文 对这４代ＤＮＡ测序技术的基本原理和特点分别进行了概述。 关键词核酸序列测序技术单分子测序纳米孔测序 基因是生命遗传的基本单位。由数以亿计的碱基 了这些测序技术的基本原理及特点。 对组成的基因组，蕴藏了生命体遗传信息的奥秘。对 １第一代测序技术 核酸序列进行测序是正确解读这部“天书”的基础，也 早在１９５４年，Ｗｈｉｔｆｅｌｄ就已经报道使用层析法测 是最为关键的一步。迄今，测序技术共经历了四代变 定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代测序技术的标志 革。２０世纪７０年代出现了第一代经典的Ｓａｎｇｅｒ测序 是Ｓａｎｇｅｒ于１９７７年发明的ＤＮＡ双脱氧核苷酸末端终 技术，人类基因组计划的实施推动了边合成边测序的 止测序法，以及Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌｂｅｒｔ于同年发明的ＤＮＡ 第二代测序技术的诞生及发展，近几年分别以单分子 化学降解测序法…。其中，Ｓａｎｇｅｒ法的核心原理是：由 和纳米孑Ｌ测序为标志的第三和第四代测序技术应运而 于ｄｄＮＴＰ的２ 和３ 都不含羟基，在ＤＮＡ的合成过程中 生。其中第二、第三和第四代测序技术统称为下一代 不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断ＤＮＡ合成反 测序（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术。本文概述 应。在４个ＤＮＡ合成反应体系中分别加入一定比例 最敏感的预测指标。父母吸烟的孩子吸烟的可能性是 ２．２．２ 家庭干预创造“无烟家庭”，在家庭中营造吸 父母不吸烟孩子的１．６５倍 Ｊ。父母吸烟的高中生有 烟有害身体健康的舆论氛围，吸烟的家庭成员要下决 更多机会接触吸烟行为，也更容易获得香烟。而且父 心戒烟；对家中的香烟严格控制，避免青少年接触；家 母吸烟使得孩子对这一行为司空见惯，吸烟的家长也 长应对吸烟行为持坚定的反对态度，发现吸烟行为后 会由于对吸烟行为没有明显的反对态度，对自己孩子 应及时进行耐心教育。 吸烟的干涉力度较小，家中的兄弟姐妹吸烟也暗示着 ２．２．３ 学校干预学校应当加强吸烟有害健康的宣 家长对该行为的漠视或默许。 传，开展以“无烟”和“禁烟”为主题的社会实践活动， ２．１．３社会因素现今的中国，吸烟已经成为一个普 组织学生参加禁烟健康教育讲座等；加强对学生吸烟 遍的社会行为。友人见面后敬烟以示尊敬的行为让高 的管理力度，发现吸烟学生后应及时与其家长沟通，严 中生误认为吸烟后可以更好地与同伴交往。烟草广 惩吸烟行为；教师应以身作则，不在学校范围内吸烟。 告、影视剧中的吸烟情节也是影响高中生吸烟的重要 人教版高中生物学教材必修一第六章第四节《细 因素。广告对青少年的影响力度是对成人的三倍，青 胞的癌变》中提到：吸烟致癌的比例高达３０％。教师 少年吸烟的１／３原因可归结于烟草广告的影响＿４ Ｊ。 在对本部分内容进行授课时，可以适当为学生补充吸 影视人物常常将吸烟者塑造为“成熟”“睿智”和“有魅 烟有害健康的相关知识，引导学生养成健康的行为习 力”的形象，潜移默化地促使高中生对吸烟行为持积极 惯，加强学生对吸烟行为的防范意识。 态度。 （基金项目：河南省教师教育课程改革研究项目， ２．２防制措施吸烟的高中生多处在尝试阶段，吸烟 Ｎｏ．２０１４一ｊｓｊｙｙｂ一０１７；第一作者为在校研究生） 行为还未定型，可以通过教育使其向积极方向思考并 主要参考文献 逐渐减少甚至戒掉吸烟，所以相应的教育及干预措施 ［１］金兰．２０１４．无呼吸道症状吸烟者肺功能的改变及干预措施． 是必要的。控制青少年学生吸烟需要学校、家庭和社 中国药物经济学，（７）：９２～９３ 会三者的有效配合。 ［２］ＨＥＣＨＴＳ Ｓ．２００３．Ｔｏｂａｃｃｏ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ，ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｔｏｂａｃｃｏ —２．２．１ 社会干预对于影视剧和烟草广告中烟草镜 ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ，３（１０）：７３３～７４４ 头应加以删减，以免对高中生产生负面的引导作用；充 ［３］韩曼雁，陈维清．２００４．中国青少年吸烟危险因索的Ｍｅｔａ分析．疾 病控制杂志，８（３）：２２７～２２９ 分利用电视、广播及互联网的宣传条件，增加禁烟公益 ［４］ＰＯＬＬＡＹ ＲＷ，ＳＩＤＤＡＲＴＨ Ｓ，ＳＩＥＧＥＬ Ｍ，ｅｔ ａ１．１９９６．Ｔｈｅ ｃａｓｔ 广告；加强监管力度，公共场所及青少年活动频繁区域 ｓｔｒａｗ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ａｄｖｅｒｔｉｓｉｎｇ ａｎｄ ｒｅａｌｉｚｅｄ ｍａｒｋｅｔ ｓｈａｒｅ ａｍｏｎｇ ｙｏｕｔｈ 禁止吸烟，严禁商店向未成年人售卖香烟。 ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ，１９７９—１９９３．Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ，６０（１）：６０ 生物学教学２０１７年（第４２卷）第１１期 带有放射性同位素标记的ｄｄＮＴＰ（分别为：ｄｄＡＴＰ、 ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ和ｄｄＴＦＰ），通过凝胶电泳和放射自显影 较第一代测序技术而言，第二代测序技术的测量 通量显著提高，是目前市场上主流的测序技术。但边 后可以根据电泳带的位置确定待测分子的ＤＮＡ序 列＿２ Ｊ。Ｓａｎｇｅｒ测序技术操作快速、简单，因此被广泛 应用。２０世纪８０年代末，荧光标记技术凭借着更加安 全简便的特性，逐步取代同位素标记技术，由此也诞生 合成边测序的原理也为其带来相应不足之处，测序读 长较短和需要模板扩增是两个主要的弊端所在。第二 代测序的读长一般在７００ ｂｐ左右，为后续的序列拼 接、组装及注释等生物信息学分析带来了较大困难；由 于ＰＣＲ反应的灵敏性，导致扩增前后得到的ＤＮＡ分 子片段的数目有较大偏差，因此在分析基因表达方面 了自动化测序技术。由于可以用不同荧光标记４种 ｄｄＮＴＰ，使得最后产物的电泳分离过程可以在一个泳 道内实现，用激光对ｄｄＮＴＰ上的荧光标记进行激发， 存在较大的弊端 Ｊ。在此基础上，无需扩增、读长更 长的第三代测序技术便应运而生。 然后检测不同波长的信号，通过计算机处理信号后即 可获得碱基序列，很好地解决了原技术中不同泳道迁 移率存在差异的问题。自动化仪测序大大提高了测序 效率，如ＡＢＩ ３７３０和Ａｍｅｒｓｈａｍ ＭｅｇａＢＡＣＥ测序仪分 别可以在一次运行中分析９６个或３８４个样本。第一 代测序仪在人类基因组计划ＤＮＡ测序的后期阶段起 到了关键的作用，使人类基因组计划比原计划提前两 年完成。但第一代测序技术存在成本高、通量低、耗时 长的缺点，严重影响了其大规模应用 Ｊ。 ２第二代测序技术 目前最具代表性的第二代测序平台包括：瑞士罗 氏公司（Ｒｏｃｈｅ）的４５４测序仪、美国Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司的 Ｓｏｌｅｘａ基因组测序仪、美国ＡＢＩ公司的ＳＯＬＩＤ测序仪 等。第二代测序技术的原理是边合成边测序，即依照 第一代Ｓａｎｇｅｒ测序技术的原理，通过测序仪器捕捉新 掺人的末端荧光标记来确定ＤＮＡ序列组成＿４ｊ。 Ｓｏｌｅｘａ测序的核心技术是ＤＮＡ簇和可逆终止化 学反应。测序前先将模板样品ＤＮＡ片段打碎形成１００ ～２００ ｂｐ的片段，然后在这些片段两端加上特定的测 序接头。而Ｓｏｌｅｘａ高通量测序芯片表面附着一层单链 引物，两端连有接头的单链ＤＮＡ片段通过与芯片表面 的引物碱基互补结合，经ＰＣＲ扩增成为双链。至此 ＤＮＡ的一端就被锚定在测序芯片上，而另一端则随机 和附近的引物互补结合，从而也被固定住，形成“桥” 式结构。这样经过反复３０轮扩增循环后，每个ＤＮＡ 片段得到约１ ０００倍扩增，形成单克隆ＤＮＡ簇。然后 掺人经过改造的ＤＮＡ聚合酶和带有４种荧光标记的 ｄＮＴＰ。这些ｄＮＴＰ就是“可逆终止子”，其３ 羟基端带 有可化学切割的部分，每个循环只允许掺人１个碱基， 用激光扫描测序芯片表面，读取聚合上去的相关核苷 酸种类。随后将这些核苷酸化学切割，恢复３ 端黏性， 继续聚合下一个核苷酸。如此循环，直至每条模板序 列都被聚合成双链。此过程中带有荧光标记的ｄＮＴＰ 能够释放出相应的荧光，测序仪据此捕捉荧光信号，之 后计算机可以将荧光信号转化为不同颜色的测序峰 图，便可得知测序样品的ＤＮＡ序列。 ３第三代测序技术 第三代测序技术基于单分子读取技术，不需要 ＰＣＲ扩增，具有巨大的应用前景。现有的第三代测序 平台包括美国Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司的ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ遗 传分析系统和Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司的单分子实时测 序系统（ＳＭＲＴ）。两者均继承了第二代测序技术的边 合成边测序的原理，其中ＳＭＲＴ系统是基于零级波导 （ｚｅｒｏ—ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ，ＺＭＷ）的测序技术。ＺＭＷ是 一种直径５０～１００ ｎｍ、深约１００ ｎｍ的孔状纳米光电结 构，当光线进入后呈指数衰减，仅靠近基底的部分被照 亮。ＤＮＡ聚合酶被固定在ＺＭＷ底部，加人模版、引物 和４色荧光标记的ｄＮＴＰ后进行ＤＮＡ合成，只有参加 反应的ｄＮＴＰ才能停留在ＺＭＷ底部，从而使ｄＮＴＰ的 荧光信号被识别 Ｊ。 第三代测序技术是计算机学、生物学、化学等多个 学科领域研究相结合的结晶，功能非常强大。其显著 特点是单分子测序，即不经ＰＣＲ，可直接进行边合成边 测序。这不仅简化了样品处理过程，避免了扩增可能 引入的错配，而且不受Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ这４种碱基含量的影 响，因此第三代测序技术能直接对ＲＮＡ和甲基化ＤＮＡ 序列进行测序。 ４第四代测序技术 第二、三代测序技术均是基于光信号的测序技术， 都需要昂贵的光学监测系统，并依赖ＤＮＡ聚合酶读取 碱基序列，大大地增加了测序的成本。因此开发不使 用生物化学试剂，直接读取ＤＮＡ序列信息的新型测序 方法，就成为第四代测序技术的主要思想【 。其中的 代表当属纳米孑Ｌ测序，如英国Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ— ｏｇｉｅｓ公司所开发的纳米孔测序，是基于电信号的测序 技术。它利用镶嵌于脂质双分子层中的经过基因工程 改造过的仅一溶血素蛋白作为纳米孑Ｌ道，孑Ｌ内共价结 合有分子接头。由于Ａ、Ｔ、Ｇ、ｃ这４种碱基存在电荷 差异，当ＤＮＡ碱基通过纳米孔时，从而短暂地影响流 过纳米孔的电流强度（４种碱基所影响的电流变化幅 度各不相同），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴 生物学教学２０１７年（第４２卷）第１Ｉ期 遗传性先天性白内障致病基因的遗传学研究进展 植瑞东 何夏怡 （广东省肇庆医学高等专科学校５２６０２０） 摘要先天性白内障是儿童常见的致盲性眼病，发病率为活产儿的１／１０ ～６／１０ ，其中约有１／３与遗传有关。迄今为止，已发 现三十多种致病基因和上百个基因突变位点与先天性白内障相关。开展先天性白内障致病基因的研究，有助于揭示先天性白内 障的发病机制，进一步了解遗传因素对晶状体代谢的影响。本文综述遗传性先天性白内障致病基因的遗传学研究进展。 关键词先天性白内障致病基因遗传学研究 先天性白内障为儿童常见的致盲性眼病，发病率 １．１ ｑ一晶状体蛋白 仅一晶状体蛋白占晶状体蛋白 为活产儿的１／１０ 一６／１０ Ｊ，约有１／３与遗传有关。 总量的４０％，包括仅一Ａ晶状体蛋白和＆一Ｂ晶状体蛋 先天性白内障可以作为孤立的眼病单独发生，也可以 白两种类型，其编码基因为ＣＲＹＡＡ和ＣＲＹＡＢ，分别定 是全身多系统综合征的眼部表现。１９６３年，Ｒｅｎｗｉｃｋ 位于２１ｑ２２．３和１１ｑ２２．３一ｑ２３．１。仪一晶状体蛋白主 和ＬａＭｅｒ在研究中发现遗传性白内障与杜非血型 要在应激状态下诱导产生，起分子伴侣的作用，能通过 （Ｄｕｆｆｙ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ）位点发生共分离现象【 。１９６８年， 与晶状体毒性蛋白结合，消除或缓冲这些物质对晶状 杜非血型被定位于１号染色体，先天性白内障成为人 体透明度的影响，维持晶状体的透明性。ＣＲＹＡＡ基因 类第一种常染色体连锁遗传性疾病。此后，许多学者 突变常发生在保守区外，如今发现与先天性白内障相 陆续发现了许多新的先天性白内障遗传位点。迄今为 关的突变位点有８个 Ｊ。 一晶状体蛋白基因突变导 止，已发现三十多种致病基因和上百个突变位点与先 致的先天性白内障在不同地域不同个体中表现出明显 天性白内障相关。 多态性，带状、板层状、核性、皮质性、后极性、Ｙ字缝状 １ 晶状体蛋白基因 白内障等表现型均有报道 Ｊ。 晶状体蛋白９０％以上为可溶性蛋白，根据蛋白在 １．２ Ｂ一晶状体蛋白 Ｂ一晶状体蛋白占晶状体蛋白 排阻色谱凝胶的洗脱顺序分类，可将其分为 一晶状 总量的３５％，根据蛋白质的等电点不同可分为Ｂ—Ａ１ 体蛋白、ｐ一晶状体蛋白和 一晶状体蛋白三种类型， 一Ａ４以及Ｂ—Ｂ１一Ｂ３两组，共七种类型的晶状体蛋 分别由不同晶状体蛋白基因编码。晶状体的透明性依 白。ｐ—Ａ１／Ａ３、ｐ—Ａ２、ｐ—Ａ４晶状体蛋白的编码基 赖于晶状体蛋白的结构和功能，编码基因发生突变可 因为ＣＲＹＢＡ１／Ａ３、ＣＲＹＢＡ２、ＣＲＹＢＡ４，分别定位于 导致晶状体蛋白结构或功能的异常，影响晶状体的透 １７ｑｌ１．２一ｑ１２、２ｑ３４一ｑ３６、２２ｑｌ１．２一ｑ１３．１；Ｂ—Ｂ１～Ｂ３ 明性，进而发生自内障。 晶状蛋白的编码基因为ＣＲＹＢＢ１、ＣＲＹＢＢ２和ＣＲＹＢＢ３， 定所通过的碱基 ｊ。 的生长发育、代谢调控、适应环境和生殖遗传等各种生 虽然纳米孔测序的优点十分明显，与前几代技术 物学过程将会有全新的认识。 相比在成本、速度方面有着很大优势。但是目前还处 在起步阶段，在关键环节（如纳米孑Ｌ的制造和ＤＮＡ分 主要参考文献 子通过纳米孔的速度控制方面）还有待改善。 ［１］刘振波．２０１２．ＤＮＡ测序技术比较．生物学通报，４７（７）：１４～ｌ７ ５展望 ［２］谢浩，赵明，胡志迪，等．２０１５．ＤＮＡ测序技术方法研究及 纵观基因组测序技术的发展历程可以看出，从第 其进展．生命的化学，３５（６）：８１１—８１６ ［３］郝甜甜，李强飞，李国治，等．２０１４．测序技术的研究进展．畜 一代到第四代测序技术无一例外地均以提高测序通量 牧与饲料科学，３５（３）：７８～８１ 与读长、降低测序成本、简化测序步骤为目标ｌ 。目 ［４］张小珍，尤崇革．２０１６．下一代基因测序技术新进展．兰州大学 前全基因组测序的费用仍旧高昂，动辄几百万元的测 学报（医学版），４２（３）：７３—８Ｏ 序费用绝非一般实验室所能承担。千元基因组甚至百 ［５］周晓光，任鲁风，李运涛，等．２０１０．下一代测序技术：技术回顾 元基因组测序一直是科学家追求的目标。另外，测序 与展望．中国科学：生命科学，４０（１）：２３～３７ 技术也决不仅仅涉及生物学问题，它综合了物理学、光 ［６］田李，张颖，赵云峰．２０１５．新一代测序技术的发展和应用． 学、电学和材料学等多种学科的知识，相信随着科学技 生物技术通报，３１（１１）：１～８ ［７］韦贵将，邹秉杰，陈之遥，等．２０１２．新一代测序技术的研究进 术的发展，符合上述要求的新一代的测序仪将会出现。 展．现代生物医学进展，１２（１９）：３７８９—３７９３ 届时，人们对自身各个生化过程和疾病发生的分子机 ［８］杨晓玲，施苏华，唐恬．２０１０．新一代测序技术的发展及应用 制等重大问题将会有更深刻细致的了解；对其他物种 前景．生物技术通报，（１０）：７６～８１