维普资讯 http://www.cqvip.com 一２５一 中国动物检疫２００８年第２５卷第９期 荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测 禽白血病病毒方法的建立及应用 ・ 李佳桃’。崔宝玉。。岳华，。李明义 。汤承’ （１．西南民族大学生命科学与技术学院，成都四川６１００４１；２．中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛２６６０３２；３．山 东畜牧兽医职业学院．山东潍坊２６６１０１） 摘 要；ｇａｇ基因是禽白血病病毒（ＡＩ ）的群特异性基因．根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的ｇａｇ基因的保守序列 （Ｅ４６３９０）．设计合成了１对引物，建立了基于ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ模式的检测禽白血病病毒的实时荧光定量ＲＴ—ＰｃＲ方 法。该方法只对目的基因有扩增，对其它无关病毒核酸无特异性扩增：扩增效率为９４．６％；在８．２×１０２－８．２×１０，拷贝的 范围内有很好的线性关系（Ｙ＝３．４６Ｘ＋３１．８，ｒ＝Ｏ．９９９５）；最低可检测８２个拷贝的病毒核酸，与普通ＰＣＲ方法相比，灵 敏度高出１０００倍。组内ＣＶ为０．２８％～１、４５％；组间ＣＶ为２．１３％ ３．８４％：对１５１例临床疑似样本的检出率为５４．９％ （８３／１５１）。随机选择１５份阳性样本ＰＣＲ产物克隆测序，结果证明扩增片断为ＡＬＶ的特异序列，与ＡＬＶ ｇａｇ基因核 苷酸同源性为９７．８－９８．９％：对重庆１４个县的１４个健康商品蛋鸡群的１３４份粪便棉拭子进行检测，ＡＬＶ的检出率为 ３８．１％．鸡群的阳性率为１４／１４。同时用实时ＲＴ—ＰＣＲ方法和ＥＬＩＳＡ方法对从种鸡场随机采集的３０份１００日龄蛋鸡 的血清进行检测．实时ＲＴ—ＰＣＲ检测率为５／３０，ＥＬＩＳＡ方法检测率为４／３０。本方法的建立为禽白血病的快速诊断、 大规模检疫、监测、流行病学调查以及药物筛选等提供了新的检测方法。 关键词：禽白血病病毒；ｇａｇ基因：实时荧光定量ＲＴ—ＰｃＲ 中图分类号：￥８５２．６５９ ３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５—９４４Ｘ（２００８）０９—００２５—０４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ ＬＩ Ｊｉａ－ｔａｏ ，ＹＵＥＨｕａ ，ＬＩ ＭＩＮＧ－Ｙｉ２，ＴＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０３２） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇａｇ ｇｅｎｅ ｉｓ ａ ｇｒｏｕｐ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｇｅｎｅ ｉｎ ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡＬＶ）．Ａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ－ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＶ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｇａｇ ｇｅｎｅ（Ｅ４６３９０）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｓｅｖｅｒａｌ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ：（１）Ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎｌｙ ｆｒｏｍ ＡＬＶ ＤＮＡ；（２）Ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌ— ｉｔｙ．ｒＩ１ｈｅ ｉｎｔｒａ—ａｓｓａｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ—ａｓｓａｙ ＣＶｗｅｒｅ ０．２８％－１．４５％ａｎｄ ２．１３％－３．８４％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； （３）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ． ｒＩ１ｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ８２ ｃｏｐｉｅｓ．１０。ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ．Ｔｈｅ ＲＲＴ－ＰＣＲ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｂｒｏａｄ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ（８．２￣１０ －８．２￣１０ ｃｏｐｉｅｓ，ｒ＝０．９９９）ｏｆ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ（９４．６％）．１５１ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｓ ８３／１５１．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ １５ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ９７．８～９８．９％ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｈａｖｅ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＡＬＶ．Ｔｏｔａｌ １ ３４ ｆｅｃａｌ ｓｗａｂｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ １４ ｈｅａｌｔｈｙ ｅｇｇ ｆｌｏｃｋｓ ｉｎ １４ ｃｏｕｎｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ．３８．１％ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆ０ｒ ＡＬＶ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＡＬＶ ｗａｓ １００％ ｆ１４／１４）ｉｎ ｖｉｕｓ－ｃａｒｒｒｙｉｎｇ ｆｌｏｃｋｓ．３０ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｙｅｒｓ ｏｆ １００ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｂｏｔｈ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ ｗｅｒｅ ５／３０ ａｎｄ ４／３０．ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｈｉｇｈｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｉｌｌ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｌａｒｇｅ—ｓｃａｌｅ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎ— ｉｎｇ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｋｏｓｉｓ Ｖｉｕｓ；ｇａｇ ｇｅｎｅ；Ｒｅａｌ－ｔｉｒｍｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 禽白血病（ＡＬ），是由禽白血病病 亡率高．给养禽业造成重大经济损 ＡＬ．但这些方法都不同程度地存在操 毒（ＡＬＶ）引起的禽类各种良性和恶 失。据调查，我国哈尔滨、北京等地部 作复杂、费时、费力或特异性不强、敏 性肿瘤的一群疾病【”。是危害养禽业 分鸡场的带毒率在２０～１００％之间．某 感性不高等缺陷。近年来出现的反转 的主要疾病之一回。各种年龄鸡均可 些鸡场禽白血病的病死率为２０～３０％ 录聚合酶链式反应（ＲＴ—ＰＣＲ）已成为 感染发病。患病鸡极度消瘦，生长发育 嘲说明ＡＬＶ在我国鸡群中的感染情 快速检测ＡＬＶ的重要手段 ．在此 不良．免疫反应低下，产蛋率下降，死 况已相当严重．并呈上升趋势。快速 基础上发展起来的实时ＲＴ—ＰＣＲ由 基金项目：国家“十一五”科技支撑计划 特异的诊断方法对本病的诊断、监测 于具有自动化程度高、检测速度快、及净化具有重要意义 目前主要通过 敏感性好、特异性强等优势．广泛用 （２００６ＢＡＤ０６Ａ０Ｉ １） 通讯作者：汤承 病毒分离鉴定和血清学技术诊断 于多种病毒病的快速诊断、监测检疫 ．维普资讯 http://www.cqvip.com 中国动物检疫２００８年第２５卷第９期 一２６一 及流行病学调查【 ＡＬＶ病毒体 ＡＬＶ ｇａｇ基因引物序列：Ｐ１：５＂－ＣＴｒＡ 性样本进行检测．每个样本设４个复 ＲＮＡ拥有典型的慢转化型反录病毒 ＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧＣ一３ Ｐ２：５ 一 管．计算其组内变异系数：上述样本 ＲＮＡ序列，可分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｊ ＴＡＧＴＣＣＡＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴ一３ ．扩增片 检ｉ贝０后一８０℃保存．每周复检１次．共 六个亚群．其中的ｇａｇ基因编码病毒 段大小为９１ｂｐ．其扩增位点为１４１９一 复检２次．计算其组间变异系数。 一 的非糖基化结构蛋白．在各病毒亚群 １５１０。 １．２．４．５实时ＲＴ—ＰＣＲ和常规ＲＴ— 间具有高度同源性 ＥＬＩＳＡ诊断ＡＬ １．２．２ ＲＡＶ一１的增殖 ＰＣＲ灵敏度的比较 都是针对ｇａｇ编码的Ｐ２７蛋白抗原 将冻干ＡＶ２２８稀释至５００ Ｌ，取 分别用实时ＲＴ—ＰＣＲ和ＲＴ— 建立的 目前未见实时ＲＴ—ＰＣＲ用 ２００ｔｘＬ接种鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）． ＰＣＲ检测１０倍系列稀释（１０１—１０９）标 于ＡＬＶ检测的报道［１１—１２］。本实验针对 ３７℃Ｃ０ 培养箱培养，每隔３天传代 准阳性样本．以比较其灵敏度。 ＡＬＶ的ｇａｇ基因设计引物，建立了检 一次．连续传至第３代备用。 １．２．５实时ＲＴ—ＰＣＲ检测临床样本 测ＡＬＶ的实时ＲＴ—ＰＣＲ．为ＡＬＶ的 １．２．３ 阳性标准品的制备 采集临床表现为生长发育不良． 快速诊断、监测及分子流行病学调查 用ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ提取 胸腺、法氏囊萎缩为主要特征的病鸡 提供了有力工具 ＡＶ２２８细胞培养物总ＲＮＡ．按照反 肝脏、法氏囊及骨髓．按１．２．３提取总 １材料与方法 转录试剂盒说明书合成ｃＤＮＡ。以 ＲＮＡ．反转录合成ｃＤＮＡ．以本研究 １．１材料 ｃＤＮＡ为模板，用下述条件扩增ｇａｇ 建立的实时ＲＴ－ＰＣＲ进行检测．阳性 １．１．１毒株及鸡胚 ＡＬＶ参考毒株 基因片段：在２５ｔｘＬ反应体系中依次 样本ＰＣＲ产物克隆测序 ＡＶ２２８、新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ９购 加入Ｐ１、Ｐ２各 １ Ｌ ｆ１０ｕｍｏｌ／Ｌ）； １．２．６病毒分离 自中国兽药监察所：禽流感病毒 ｄＮＴＰ ２ Ｌ ｆ２．５ｍＭ）；２５０ ｍＭ ＭｇＣ１２ 随机挑选４个实时ＲＴ—ＰＣＲ阳 （ＡＩＶ）Ｈ５亚型、禽网状内皮综合症病 １．５ Ｌ；１０ ｘＰＣＲ缓冲液２．５ Ｌ； 性样本．研磨和无菌处理后接种ＳＰＦ 毒（ＲＥＶ）、减蛋综合症病毒ｆＥＤＳＶ）抗 ＴａｑＤＮＡ聚合酶ｆ５Ｕ／ Ｌ）０．１２５７Ｌ， 鸡胚成纤维细胞，３７ ｏＣ ５％ＣＯ 培养 原由中国动物卫生与流行病学中心 ＤＮＡ模板２ Ｌ，用超纯水补足至 箱培养，每隔３天传代一次．连续传至 提供：传染性支气管炎（ＩＢ）Ｈ５２弱毒 ２５１￣Ｌ：扩增参数为：９５ｏＣ ３ｍｉｎ：９４ｏＣ 第３代，将细胞培养物用１．２－３中的方 疫苗、鸡传染性法氏囊（ＩＢＤ）弱毒疫 ３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，３５个循环： 法提取ＲＮＡ．反转录后用本实验室建 苗、马立克氏病（ＭＤ）疫苗由乾元浩 ７２℃延伸１０ｍｉｎ：４℃结束反应．ＰＣＲ 立的实时ＲＴ—ＰＣＲ进行鉴定 生物股份有限公司生产：传染性喉气 产物用２．５％琼脂糖凝胶电泳．ＧＯＬＤ １．２．７健康商品蛋鸡携带ＡＬＶ的分 管炎（ＩＬＴ）弱毒疫苗由Ｂｉｏ Ｌａｒｙｎｇｏ ＶＩＥＷ染色．目的片段连接ＰＭＤ１８一Ｔ 子流行病学调查 公司生产：鸭瘟病毒（ＤＰＶ）由西南民 Ｖｅｃｔｏｒ．转化ＤＨ５ｏ￣感受态细胞．挑选 用本研究建立的实时ＲＴ－ＰＣＲ对 族大学动物医学教研室分离保存 阳性菌落．进行菌液ＰＣＲ鉴定后．用 重庆市１４个县的１４个健康商品蛋鸡 ＳＰＦ鸡胚为从南京兽医药械厂购买 质粒提取试剂盒提取阳性质粒ＤＮＡ． 群的１３４份粪便棉拭子进行检测 的ＳＰＦ种蛋自行孵化 送成都金杰生物技术有限公司测序 ２结果 １．１．２主要仪器７３ｏ０型荧光定量 经测序验证的阳性质粒用紫外分光 ２．１引物的特异性 ＰＣＲ仪．美国ＡＢＩ公司：ＶｅｒＳａ 光度计测定ＤＮＡ标准品在２６０ｎｍ 本研究设计的引物能从阳性标 Ｄｏｅ２０００凝胶成像系统．美国Ｂｉｏ— 处光吸收值（Ａ２６０）．采用文献㈣介绍 准样本中扩增出１００ｂｐ左右的产物． Ｒａｄ公司：ＰＸ２梯度ＰＣＲ仪．美国 的方法，按如下公式计算其拷贝数： 与预计片段大小相符．（图１） Ｔｈｅｒ／ｌＣｌｏ Ｈｙｂａｉｄ公司：ＤＵ￣８００紫外 １ ｇ １０００ｂｐ ＤＮＡ＝９．１×１０“ 分光光度计．美国Ｂａｃｋｍａｎ公司： 作为本研究的标准阳性样本 ５８０４Ｒ台式高速冷冻离心机．德国 １．２．４实时ＲＴ—ＰＣＲ方法的建立 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。 １．２．４．１反应体系优化 １．１．３ 主瑟拭剂：ＲＮＡｉｓｏ Ｒｅａｇｅｎｔ、 以得到最小的ＣＴ值并且在熔解 ｄＮＴＰ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ、ｐＭＤ 曲线分析中不产生非特异性峰为指 １８一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、反转录试剂盒由日本 标。分别优化退火温度和引物浓度 Ｔａｋａｒａ公司生产．Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｐｌａｓｍｉｄ １．２．４．２实时ＲＴ—ＰＣＲ标准曲线建立 Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｉ质粒提取试剂盒由 将标准阳性样本连续ｌ０倍系列 ＯＭＥＧＡ公司生产．ＡＬＶ—ＡＧ ＥＬＩＳＡ 稀释．用优化的实时ＲＴ—ＰＣＲ条件进 Ｋｉｔ由美国ＩＤＥＸＸ公司生产 行扩增．以病毒拷贝数为横坐标．以 Ｍ：ＤＮＡ分子量标准；１泳道：无模板对照： １．２方法 Ｃｔ值为纵坐标建立标准曲线 ２～ｓ泳道：阳性质粒 １．２．１引物设计 １．２．４．３实时ＲＴ—ＰＣＲ方法的特异性 圈１ 标准阳性样本ＰＣＲ产物电泳圈 参考ＧｅｎＢａｎｋ中３０个ＡＬＶ毒 用优化的实时ＲＴ—ＰＣＲ条件分 ＰＣＲ产物测序结果分析显示为 株的ｇａｇ ｍＲＮＡ核苷酸序列．利用 别检测ＡＩＶ、ＮＤＶ、ＥＤＳＶ、ＩＢＶ、ＲＥＶ、 ＡＬＶ ｇａｇ基因特异性序列．与Ｇｅｎ— ＤＮＡｓｔａｒ生物软件进行同源性分析比 ＩＢＤＶ、ＩＬ１’Ｖ、ＭＤＶ、ＤＰＶ 以及正常 Ｂａｎｋ中３０个ＡＬＶ ｇａｇ基因核苷酸 较．选出高度保守且特异的核苷酸区 ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞的核酸样本．以 序列同源性为９７．８～９８．９％ 域。利用Ｐｒｉｍｅｔ ５．０和Ｏｌｉｇｏ６．０软件． 评价其特异性 ２．２实时ＲＴ＿ＰＣＲ反应优化条件 设计一对引物．采用ＢＬＡＳＴ工具进 １－２．４．４复性和再现性 采用２０ Ｌ反应体系：ｓＹ 行检索．初步验证其特异性。引物由 用优化的实时ＲＴ—ＰＣＲ条件对 Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ １０ Ｌ，ＲＯＸ ０．４ Ｌ 成都金杰生物技术有限公司合成 从１０—２到１０－ｓ的４个稀释度标准阳 Ｐ１、Ｐ２各０．４ ，ｃＤＮＡ ２ ，用ｄｄＨ２０ 维普资讯 http://www.cqvip.com 一２７一 中国动物检疫２００８年第２５卷第９期 补到２０１．￣Ｌ。反应条件为９５℃２ ｍｉｎ： 表１ 实时ＲＴ－ＰＣＲ检￣ＩＪＡＬＶ的可重复－陛 ９４℃１５ｓ。５８℃３０ｓ共４０个循环。 ２－３标准曲线 实时ＲＴ—ＰＣＲ的标准曲线图见 图２ 表２实时ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＬＶ的再现性 本。而且反应都在一个密闭管系统中 进行，避免了ＰＣＲ产物污染问题：检 测速度快。从病料处理到报告结果检 测可在５ ｈ内完成。本方法的建立． 不仅克服了定期检测时病毒细胞分 离费时、费力的缺点．而且可以用于 活禽和禽产品中的快速检测．为鸡场 尽快采取针对措施节省时间．减少损 失。也为以后禽白血病的临床辅助诊 断、检疫、疫苗中ＡＬＶ污染检测、流 行病学调查以及药物筛选等提供了 新的检测方法 ３．２ ＡＬ对养禽业危害严重 ＡＬＶ感 染前期虽不产生明显可见肿瘤．但可 实时ＲＴ—ＰＣＲ对临床样本中 诱发鸡群的免疫抑制状态．引起感染 ＡＬＶ的检出率为８３／１５１．测序结果分 鸡只消瘦．产蛋下降等问题．还会导 析显示．扩增片段为ＡＬＶ ｇａｇ基因的 致不同程度的继发感染、二重感染和 特异片段．与ＡＬＶ ｇａｇ基因核苷酸的 多重感染。如新城疫、大肠杆菌病等 同源性为９７．８—９８．９％。 ［ 。韦平［１５ ｑ等用ＰＣＲ方法对广西６ ２．９病毒分离鉴定 个地区的１３９个鸡群中临床表现为 将病毒分离培养物在优化的条 免疫抑制、多重感染的５０５只病、死 图２实时ＲＴ－ＰＣＲ标准曲线的建立 件下进行常规ＰＣＲ扩增．经２．５％琼 鸡的肿瘤及可疑肿瘤组织样品共 标准曲线在８．２ｘｌ０２ ８．２Ｘ１０７拷贝范 脂糖凝胶电泳分析 在１００ｂｐ位置左 １５７０份进行检测．ＡＬＶ阳性率为 围内呈现良好的线性关系．相关系数 右出现一条特异性条带．表明分离到 ６．７３％．鸡群阳性率为１４．３９％ 本研 为（ｒ＝０．９９９５，扩增效率为９４．６％，检 的病毒为ＡＬＶ（图４）。 究对临床表现为生长发育不良．胸 测下限为８２拷贝）。 腺、法氏囊萎缩、骨髓褪色为主要特 ２．４熔解曲线分析 征的病鸡组织中ＡＬＶ的检出率为 熔解曲线分析可见．在Ｔｍ＝ ５４．９７％．对健康商品蛋鸡群粪便中 ８１．７＋０．８ｃＩ＝出现一单特异峰．无引物 ＡＬＶ的检出率为３８．１％．说明ＡＬＶ在 二聚体及非特异性产物（图３）。 鸡群和环境中普遍存在 我们对这些 嘲 蛾 ｝｝ ｝ ＿ 被检临床病例的流行病学调查分析 发现．免疫器官损伤病例多见３０ ７０ ，１３龄，ＡＬＶ可能是通过种蛋感染．也 ｛ ｒ 可能是出壳后经环境或污染疫苗感 ｂ一 一’— 染．我们对不同厂家生产的几种弱毒 １：ＤＮＡ分子量标准；２：无模板对照； 疫苗的检测结果显示．疫苗中ＡＬＶ ３：阳性对照；４＂－７：病毒分离培养物 污染严重（未发表）。这可能是造成我 图３实时ＲＴ．ＰｃＲ的熔解曲线Ｔｍ＝８１．７－－Ｉ－０．８℃ 图４分离瘸毒的ＲＴ—ＰＣＲ鉴定 国目前鸡的一些重要传染病免疫失 ２．５可重复性及再现性 ３讨论 败的重要因素之一旧 实时ＲＴ—ＰＣＲ检测ＡＬＶ的组间 ３．１本研究建立的实时ＲＴ—ＰＣＲ方 ３．３ 由于本研究是针对ＡＬＶ的群 变异系数为０．２８ １．４５％（表１），组内 法特异性强、灵敏度高、重复性好、操 特异性基因设计引物建立的实时 变异系数为２．１３ ３．８４％（表２）。 作简便 禽白血病给我国养禽业造成 ＲＴ—ＰＣＲ．无法鉴别样本中检出ＡＬＶ ２．６特异性 的经济损失巨大，但本病目前并无有 的ｇａｇ基因序列是来自内源性还是 特异性检测结果显示实时ＲＴ— 效的治疗方法．也无有效的药物及疫 外源性感染．因此．对临床样本的检 ＰＣＲ只能从ＡＬＶ阳性样本中检出扩 苗．建立快速、特异和高通量的检测 测不可避免假阳性结果的出现．这是 增信号．不与ＡＩＶ、ＮＤＶ、ＥＤＳＶ、ＩＢＶ、 方法．及时检出和淘汰病鸡是控制本 本方法的缺陷 实时ＲＴ—ＰＣＲ的检测 ＲＥＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬ１Ｖ、ＭＤＶ、ＤＰＶ以及正 病的主要手段。本研究首次建立了检 结果需结合临床症状综合判定 常ＳＰＦ鸡胚成纤维细胞等发生交叉 测禽白血病的ＲＲＴ—ＰＣＲ方法．该方 参考文献 反应。 法特异性好．只从禽白血病阳性样本 【１】Ｓｉｌｖａ Ｒ Ｆ，Ｆａｄｌｙ Ａ Ｆ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＡＬＶ－Ｊ ２．７灵敏度 中能检测出特异性扩增信号．不与本 Ｓｔｒａｉｎｓ ［Ａ］／／Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ 实时ＲＴ—ＰＣＲ的最低检测限是 研究检测的其他常见家禽病原发生 ＡＬＶ－Ｊ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｖｉａｎ ｍｔｍｖｉｍｓｅｓ【Ｃ】． ８２拷贝／反应．而常规ＲＴ—ＰＣＲ最低 非特异性反应．扩增片段经测序证明 Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ：Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ 检测限是８．２ｘ１０４拷贝／反应。 为禽白血病病毒的特异序：对ＡＬＶ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０００．２３－３０． ２．８临床样本实时ＲＴ—ＰＣＲ检测结 检测的敏感性达到８２个拷贝／反应： ｆ２１ Ｂ．ｗ．卡尔尼克．禽病学（第十版）ｆＭ］／／高 福．刘文军译．北京：中国农业大学出版社。 果 通量高．一次可以实时检测９６个样 １９９９，５—９． 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国动物检疫2008年第25卷第9期11]成子强『一28一M1北京：中国农业31甘盂侯中国禽病学『『出版社1999：3540．．．．郝永清等应用ELISA方法调查禽骨髓细胞瘤病『J1中国，赵心力，，．[17】SilvaveRFo，FadlyAMTaylorSP，．De—．lopmerenentafavpolymerasecvhaiirusnreactionsuto[4]oSmithLM，BrowentannSRHow，esKDevel．—家禽200224f6)：910—，，．fdifH，itteateciannleoreukosisan’fALvJconvaccban—pmdapplicationtesuofpolymeraseochainsu[12】LegofeJl—，BouhlaleGreansenguetnvvGo，groups：detiofALVtamint．reaction(PCRlavtsforthedetectionvfbe—tna1．RsaeaTimPCRoqusicatiotifxfsincommercialMa，ksdiseaseines[J】groupJsearc，ianlekosis—Jrus【J】Virus．一Rgeital8798h199854：，，．(HSV)，heddingndhumafimherpemunosimpleciruAvianDiseases200751(3)：6376，，．ndefite．iencywirus5】宋素泉付朝阳高宏雷等．J亚群禽白【血病JL2株的分离鉴定[J】中国预防兽，一fHIVlnainwomen．coinfecdith，HSV44．dHIV[J1ClinMicrobi012006(2)：181成子强赵振华郝永清等禽白血病『病毒J亚群(ALVJ1的血清学调查及PCR诊断【J】中国病毒学200217(4)：，，．—．，，医学报2003，，25f5)：142，～145．423432．324，329．『61萨姆布鲁克J弗里奇EL曼尼阿蒂斯T分子克隆实验指南(第2版)『M1北京：科．．[13]GiuliettiAOverbea1An．rgh—lLVa，ckxD，et19】Yoon【aHA，EooSK，AleyaseuAGv，e—tovervaiewofrealtimequantitative1In．vesigationtfpsitedorabieosirusla学出版社2002．．PCR：，．pplicatiopre．nsto．quantify，cytokine，tencyexinpnervousssuesfseropositive『71崔治中张志杜岩我国肉用型鸡群中J亚型白血病流行现状的调查『J]中国预，．—geneexssionfJ]1，Methods200125(4)：pigsosedtoifld—strain【J]．VetMed386401Sci，，．，2006，68(2)：143，，148，．141韦平王桂军何秀苗等鸡肿瘤病快防兽医学报200224f41：292294『M】速鉴别诊断试剂盒及其应用研究【J】中[8】殷震刘景华动物病毒学(第2版)【国兽医科技200512(1)：北京：科学出版社19976267，，．，．．．201蒋桃珍谷红李宁等禽白血病／N瘤『病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其．—．．．．．抗体的制备fJ】中国兽药杂志200640．，，[9]navPayneLNHistory．ofALV—／InJ[A]／anterra15]【oHauptliDBruckn，erseL，OttigerHPUse．tionanrelsymposiuvmon．ALVJdothefReeacverseTranscriptanPolymcceraseeChainniatroirusess[C】Rauischholzhauerssen—，RnaitnonforDetectiou．ofVainsCo．tami—Germany：Justu，LiebigUniv，，．ity2000：3．9．tiobyAvianLe—kosisViruⅢJvjmI(10)：1-421】王桂军PCR技术鉴别诊断鸡肿瘤病【的应用研究【D1南宁：广西大学2002f22I王桂军韦平李康然等PCR和核酸．．．，．，，，．10】韩静陈晨曹红等禽白血病病毒【p27基因在原核细胞的表达及生物学特Meth199766：7178，，，，性的初步分析[J]病毒学报．，200521(4)，：5458．16】韦平王桂军何秀苗等鸡肿瘤病快【速鉴别诊断试剂盒的研制及其应用『J]中国兽医科技200232(12)：35，．探针技术诊断鸡肿瘤病的比较研究『J1中国预防兽医学报200325f61：393490．—，，．．。．．23】韦平马立克氏病研究的最新进展[J]【广西农业生物科学200019f2)：110115．一．，，．