透明质酸的功能、制备及其在医学中的应用

透明质酸的功能、制备及其在医学中的应用

作者：杜平中

来源：《上海医药》2012年第15期

摘 要 透明质酸是一种天然的线性黏多糖，具有特殊生理功能。本文简介透明质酸的功能、各种制备方法以及在医学方面的进展。 关键词 透明质酸 功能 制备 治疗

中图分类号：R91; R96; TQ464.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2012)15-0046-06 The function, preparation and medical application of hyaluronan DU Ping- zhong

(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040, China)

ABSTRACT Hyaluronan is a natural linear mucopolysaccharide which possesses the special physiological functions. This review briefly introduces the functions, preparations of hyaluronan and its progress applied in medicine.

KEY WORDS hyaluronan; function; preparation; therapy

透明质酸又名玻璃酸（hyaluronan或hyaluronic acid，HA），是Meyer等[1]于1934年从牛玻璃体分离获得并命名。由于HA是人体皮肤、关节软骨等组织的天然组分，又在人体的生理代谢中具有特殊功能，近年来受到人们愈来愈多的关注，在医学、药学和化妆保健品方面得到广泛的开发和应用。据估计HA销售在国际上超过10亿美元，在大大地促进HA的研发和生产。本文对HA功能、生产和医疗保健方面的应用进展作一概述。 1 透明质酸的性质与功能 1.1 HA的分布

HA是由β-3-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和β-1,4-葡萄糖醛酸（GlcA）双糖重复单位构成的线性黏多糖。HA在自然界中分布广泛，是细胞外基质组份，哺乳动物的结缔组织，关节滑液、皮肤、眼玻璃体、脐带以及鸡冠、鲸鱼软骨、鲨鱼皮、海藻、软体动物都含有HA，在原核细胞中它以黏性荚膜存在。在人体中，皮肤含7～8 g HA，占总量的50%以上，脐带和关节滑液HA含量也很丰富[2,3]（表1）。 1.2 HA的性质

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HA为白色无定形或纤维状物资，无臭，有强吸湿性，易溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂，水溶液呈酸性，带负电。

HA经酸碱或加热处理，易引起分解，在还原剂，氧自由基，紫外线，X射线或超声波等的作用下，可使其低分子化。HA还易被透明质酸酶和硫酸软骨素酶等分解[5]。 1.3 HA的保水性

HA含有多个羟基和羧基，能与水分子形成氢键，有强大的保水作用，理论保水值达500 ml/g。它的保水性与甘油等一般保湿剂不同，不易受外界环境影响，不论在低湿度还是高湿度条件下，吸湿性大致相同，因此，HA是一种理想的保湿剂，保湿效果与分子量大小有关，分子量越大保湿效果越好。皮肤保健就是利用这一特性[6]。 1.4 HA的黏弹性

HA在低浓度时，以线状形式存在，在高浓度时（1%），分子以网状结构存在，有很高的黏弹性。分子量约200万0.2%水溶液黏度为1 000 CPS，当浓度增至1%时，其黏度增加1 000倍。黏度大小还受分子量、pH和离子强度等因素影响[5]。 1.5 HA的流变性

在溶液中，HA线性分子骨架内部氢原子形成非极性疏水面，外部侧链形成亲水面，出现一种扭曲的盘旋带状结构，具有很独特的流变性质，超常的润滑性和很强的亲水性。在低浓度时，有异常的流变性，在较高浓度时，有极高但依存剪切的黏度。1% HA溶液象冻胶，但在压力下，它很容易通过小针孔，被称为“假塑性材料”。HA溶液独特的流变性质使它成为理想的润滑剂，已成功地用于防止手术后黏连[7]。 1.6 HA的生理功能

HA是细胞外基质的必需组份，参与和中介细胞信号传递，伤口修复，形态发生和基质组织等生理活动，它能调节与巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞相互作用。在高浓度下，HA抑制巨噬细胞的增殖、移行和吞噬能力，在低浓度下，它反而增强巨噬细胞的吞噬和胞饮能力。对淋巴细胞，它抑制宿主对移植物反应，阻止其增殖[7]。它参与细胞的分化调控，与肿瘤的转移有密切关系[3]。

HA是带酸性基团的生物大分子，对细胞外的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等阳离子有较大亲和力，能调节这些阳离子在细胞表面及其周围的变化。HA分子可任意卷曲形成三维空间网络，具有分子筛功能，小分子易通过，大分子则受阻，起着调节蛋白质转运的功能[2]。 1.7 HA的安全性

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HA是人体结缔组织的主要成分，与蛋白质结合存在于机体各组织内，本身有极高安全性，大鼠急性毒性LD50：口服500 mg/kg，皮下和腹腔注射2 000 mg/kg。它无抗原性，无过敏反应，无致畸、致突变和致癌作用[6,7]。这表明HA安全可靠，不仅可作为医药用品，而且还可作为保健化妆品基质，得到广泛的应用。 2 透明质酸的制备

由于HA的优良性能以及它在医疗和保健化妆品上的广阔应用前景，人们一直在研究和开发HA的各种制备方法，从传统的提取法发展到微生物发酵法，直至用基因重组技术，改造原有菌种或构建新的微生物产生菌，都取得显著的进展。 2.1 动物组织提取法

在机体组织中，HA几乎都与蛋白质以共价键结合成蛋白聚糖，通常鸡冠、人脐带、牛或猪眼玻璃体和皮肤等含量较高，作为起始原料，经机械切块破碎后，用碱或蛋白酶降价，使HA与蛋白质分离，用氯仿等有机溶剂去除蛋白质杂质，其溶液经乙醇多次沉淀，再经氯化十六烷基吡啶和无菌处理等精制过程，得到无菌无热源高纯度HA制品[2]。提取时，要防止透明质酸酶和加温使HA降解低分子化。鸡冠等提取工艺耗时费力，劳动强度大，生产成本高，易受HA降解酶影响，制造高纯度高分子量产品很困难，而且动物来源大分子有跨种间风险和病毒污染可能，面临着日益增长的反对，从20世纪80年代起，微生物发酵法逐渐兴起，大有替代提取法之势。

1980年瑞典Pharmacia公司首先从鸡冠制备出医用级HA，占领市场，之后日本、中国等国相继开发出同类产品，参与竞争。 2.2 微生物发酵法

能合成HA的微生物主要有溶血性链球菌，1937年报道链球菌A群产生HA，之后发现链球菌C群也产生HA，HA存在于链球菌的荚膜上，为细菌提供一种隐蔽功能，使机体免疫系统不能识别，免受白细胞的攻击。A群和C群链球菌分别为人和动物的致病菌，前者对人危害大，不适合生产，后者虽对动物致病，但经诱变选育出低毒菌株，可在严格控制下生产，常用的生产菌株(表2)是马链球菌、兽疫链球菌和类马链球菌的突变株[5,8]。

与提取法相比，发酵法工艺比较简单，HA以游离态分泌到发酵液中，不含难以分离的蛋白质和其他黏多糖，容易得到高纯度高分子量的HA，适合于工业规模生产。常用的生产菌株为兽疫链球菌和马链球菌的突变株。1982年日本资生堂开始研究发酵法，1985年开发成功，突变株的HA产量大于5 mg/ml，达到工业化生产要求[5]。典型的HA发酵过程是以葡萄糖为主要碳源，在含蛋白胨、酵母膏、磷酸盐和硫酸盐等成分的培养基中，在34～37 ℃，pH 7及通气搅拌条件下，经过30～48 h发酵，HA产量可达5～7 mg/ml.。发酵液离心去菌体，加沉

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淀剂去蛋白质，溶液加乙醇沉淀HA，再经氯化十六烷基吡啶、超滤、透析和离子交换等技术处理，去除微量杂质热源，制得高纯度医用级HA[2]。

HA的发酵受到菌种、基因、培养基和发酵过程各种参数的影响。首先，现在HA生产菌种多为动物致病菌，菌种本身可能分泌透明质酸酶使HA水解，并产生β-溶血素，菌种经NTG等诱变剂处理和一系列选育，以获得无HA水解酶和溶血素的HA高产菌株。其次，培养基的组成也十分重要，链球菌对营养有特殊要求，尤其是营养缺陷型菌株，氮源（酵母膏，蛋白水解液），碳源（葡萄糖，蔗糖）以及二价金属离子(Mg2+、Mn2+)等适当配合，以求获得最佳组合。第三，发酵参数的调控，pH，溶解氧，搅拌转速和型式，菌浓度和糖氮消耗等进行优化组合，由于HA发酵液的高黏性，影响氧和营养物质的传递，这样，HA的产量达5～7 g/L已接近极限[2,8]。

目前，发酵法生产HA占主导地位，日本，欧美和中国都已规模化生产，产品的竞争也日趋剧烈。

2.3 基因重组菌种发酵法

最近十几年，有关链球菌基因测序和代谢工程研究取得很大进展，为构建基因重组菌种打下基础。HA生产来自动物组织或致病菌发酵，给安全生产带来一定风险，美国FDA和欧洲EMEA对其生产工艺有严格限制。20世纪90年代起，美欧日等国投入巨资，探索用基因工程技术构建非致病菌，开辟了一条转基因HA生产新途径，近年来取得突破性的进展，有的已经产业化。枯草杆菌等转基因HA产生菌属于一般认为安全认证（GRAS）的菌种，特点是安全性高，无病毒污染或传播动物病原菌的风险，宿主不产生任何内外毒素，且培养条件要求低，发酵产生的HA直接分泌到培养基中。表3列出HA基因重组菌种等。

枯草杆菌是具有生物合成HA能力的革兰阳性菌，除没有透明质酸合成酶外，含有所有必需的酶系。链球菌生物合成HA的关键酶，在枯草杆菌中都有类似的酶。例如，HA产生菌类马链球菌有透明质酸合成酶基因（hasA），合成HA前体所需的关键酶基因，UDP-葡萄糖脱氢酶基因（hasB），UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（hasC），UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因（hasD），与天然枯草杆菌相应前体基因分别为tuaD (hasB类似物)，gtaB（hasC），gcaD (hasD) （图1）。将链球菌的hasA与枯草杆菌一个或多个tuaD，gtaB，gcaD作为基因盒整合到枯草杆菌A164D5的amyE所在的染色体上，可获得高基因稳定性。HA合成过程如图2[15]，与尿苷二磷酸（UDP）结合的GlcNAc和GlcA单糖进入细胞膜上透明质酸酶内交替转位连接到线性HA上，之后分泌到细胞外。该菌株在以蔗糖为基础的培养基中发酵，产生HA分子量约100万，且低分散度，质量好，工艺简单且环保[8,10]。这表明基因工程法虽然产量不及发酵法，但鉴于基因技术和代谢工程的优势，生产工艺安全，产品有保证，前景看好。 3 透明质酸在医学中的应用

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HA具有独特的高吸湿性和黏弹性，良好的生物相容性，无免疫原性以及降解产物安全等性质，并有多种生理调节功能，因此，它的应用领域在不断扩大。仅在医学范围里，其在眼科，耳鼻喉科，骨科，外科，皮肤科，整形科，组织工程等方面的应用均有报道。在药学中，除了用作药物治疗外，还可用作药物载体，调节和控制药物的吸收与释放。在美容保健化妆品行业，更成为一种常用不可缺失的基质。由于HA在机体里易被透明质酸酶或自由基降解，半衰期几小时到几天，不能满足外科，皮肤科和组织工程等的临床需求，一些HA的衍生物和交联物已开发成功，并开始用于临床。 3.1 眼科

20世纪80年代，瑞典Pharmacia公司首先将HA产品作为眼外科手术填充剂应用于临床，目前，HA在白内障摘除、人工晶体植入、角膜移植、视网膜脱离等称为眼科黏性外科手术中得到普遍应用[16]，到2009年至少2 500万患者从中得益。HA在手术中滞留于前房，保持手术视野清晰，保护角膜内皮和虹膜组织，减少术间出血和损伤，降低术后炎症，提高手术成功率。HA对角膜有保护作用，与纤连蛋白结合，促进角膜上皮细胞连接和延伸，加快角膜创伤愈合。近来报道，HA与羟丙甲基纤维素二元组合制剂更适合眼科手术[17]。

以HA为主要成分的滴眼药液，具有强亲水能力和润滑作用，可稳定泪膜，延长泪液破裂时间，防止角膜和结膜干燥，减轻眼组织摩擦，缓解干眼症的不适症状，用于治疗干燥综合症，眼干燥症，以及手术、外伤和配戴隐形眼镜所致的角膜结膜上皮损伤，也用于改善隐形眼镜配戴舒适度[17]。 3.2 耳鼻喉科

鼓膜穿孔是由中耳感染、外伤等引起的，尤其对儿童学习语言有很大影响。HA制剂以及衍生物直接滴入鼓膜穿孔患者中耳内，可加快穿孔鼓膜的闭合，改善疤痕质量，缩短愈合时间，产生新鼓膜，改进听力，且对耳蜗无毒性[18]。这是一种技术简单，经济省时的方法，适合于干性鼓膜穿孔患者的鼓膜成形术。目前，还需进行大规模随机对照临床试验后，才能确保HA常规使用[19]。

在声带襞瘢痕治疗上，HA交联后有希望用于声带开始损伤时防止瘢痕生成，而对已形成的瘢痕可使固有膜复原，但其疗效仍需进一步确认[20]。 3.3 骨科

HA注入关节腔内，增强关节液的润滑功能，促进软骨的愈合与再生，抑制疼痛，减少炎症，用于治疗各种骨关节炎取得较好疗效[21,22]。另外，在退行性关节炎和整形科领域，如对椎间盘退化的修复与再生，HA能促进软骨细胞分化，维持椎间盘和骨髓基底细胞活性，也显示出治疗潜力[23]。 3.4 外科

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在腹部手术后，腹腔黏连并发症的风险约为29.7%，最常见的并发症是小肠梗阻，病人需重新入院治疗。HA作为基质的抗黏连剂，可使手术时暴露在空气中器官组织保持水分，减少或防止相互黏连。机理是在受损的腹腔表面HA进行机械隔离，也有调节细胞增殖的作用。HA-CMC(羧甲基纤维素)制成的无菌可生物再吸收的抗黏连膜，1996年美国FDA批准用于腹腔手术防黏连，如经腹腔镜治疗溃疡性肠炎，家族性结肠息肉，子宫肌瘤切除和疝修复等都很有前途[24]。 3.5 皮肤科

HA用于烧伤、创伤或皮肤溃疡治疗时，涂敷在伤面上，形成一层薄膜，既可免受细菌感染，又可透气保持创面干燥；低分子HA还能渗透到真皮层，促进上皮再生，促进愈合。HA局部用于治疗急性放射上皮炎，腿静脉溃疡和糖尿病脚等[25]。 3.6 组织工程

HA是细胞外基质的必需成分，由于它无毒、极好的生物相容性和降解性[26]。在组织工程和再生医学中，以HA为基础的生物材料，构建成合成的细胞外基质，作为支架和载体，参与干细胞传递，生长分化，组织修复，形态生成等生理活动，成为制造新型机体组织最重要的建筑块[27]。如从皮肤、肝脏、心肌、软骨和神经等组织获得的先祖细胞和成熟细胞，可按规格定制培育出所需的组织与器官[28,29]。 3.7 药物传输系统

HA是多种生理功能的天然线性多糖，不仅用于组织工程前景广阔，而且作为药物载体也进展迅速。HA及其各种衍生物、交联物制成液体、凝胶、微粒和膜等剂型，可将生物活性小分子或蛋白多肽大分子，通过局部给药，注射，植入等方式将药物送至疾病部位，达到药物缓释或控释的目的[30,31]。HA与肿瘤细胞上过表达的CD44受体亲和力较强，有望成为癌症靶向治疗的手段[31]。美欧国家批准HA作为双氯芬酸钠的药物载体，明显延长药物半衰期，局部治疗光化角化病、骨关节炎、基底细胞癌等[32]。 3.8 保健化妆品

HA优良的吸湿性，对皮肤又无毒无刺激，能清除自由基，几乎所有各种化妆品如乳剂、霜剂、唇膏、香波和浴剂等都含有HA。它有助于皮肤水化，吸收水分，形成薄膜，渗透到上皮中去，还可防止皮肤免受紫外辐射[33]。皱纹是由于皮肤老化和HA丢失引起的，2003年美国FDA批准HA注射液用于去除脸部的皱纹，填充软组织缺损，增加皮下空间，减少皱纹深度，使脸部平滑[34]。 4 结语

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HA是一种黏性高分子的多糖，在现有的生物提取法，发酵法和基因工程法中，后二者在工艺路线，产品安全和生产成本上具有更大的优势。HA优良的生物理化特性和多种多样的生理功能，使其在医药保健领域里得到广泛的应用，它的各种衍生物将成为组织工程和药物传输系统中所需的新型生物材料和载体。 参考文献

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