烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究

J］．江苏农业科学，2016，44（11）：148－150．王铁军，钟万芳，朱丽梅，等．烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究［doi：10．15889/j．issn．1002－1302．2016．11．044

烟粉虱病原真菌的分离鉴定及生物活性初步研究

231

王铁军，钟万芳，朱丽梅，王

1

耘，陈

444冬，康秋玉，赵明珠

（1．金陵科技学院园艺学院，江苏南京210036；2．南京新农科创投资有限责任公司，江苏南京211134；3．江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京210014；4．南京清雅花卉专业合作社，江苏南京211134）

摘要：对田间分离的死亡烟粉虱虫体进行保湿培养，分离得到1株具有杀虫活性的菌株，通过对该菌株的形态、培

养特征的观察及对其ITS核酸序列进行扩增与分析，鉴定该菌株为玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）。采用浸渍法测

7定该菌株对烟粉虱2龄若虫的生物活性，结果表明，在孢子浓度为1．0×10CFU/mL时，孢子加菌丝悬浮液处理的虫

其72h和120h的平均死亡率分别为39%和62%，其次为单用孢子悬液处理，死亡率分别为35%和体死亡率最高，

52%，但两者无显著差异，单用菌丝处理的死亡率最低，分别为20%和38%，与前2种处理方式结果有显著性差异，说

明菌株QH1可能主要是通过孢子侵染烟粉虱虫体而表现出杀虫活性。

关键词：烟粉虱；病原真菌；分离鉴定；生物活性

中图分类号：S433．39

文献标志码：A

文章编号：1002－1302（2016）11－0148－03

烟粉虱（BemisiatabaciGennadius）广泛分布于除南极洲以外的90多个国家，是一种杂食性害虫，其寄主植物超过

［1－2］600种，。包括棉花、多种蔬菜以及多种观赏植物和花卉烟粉虱危害方式多样，不仅可以直接吸取植物汁液、分泌蜜

且多为丝孢菌纲，主要包括轮枝菌（Verticilli-真菌种类繁多，

um）、拟青霉菌（Paecilomyces）和座壳孢属（Aschersonia）的一些种类

［4］

。这些天敌中的很多都能取食或寄生大量烟粉虱，

还可以传播多种植物病毒，给农业生产带来了严重的危露，

［3］

如何对烟粉虱进行有效的治理和控制引起了国害。因此，

内外学者的广泛重视，并积极研究有效防控烟粉虱的策略和

方法。实践证明一些农业和物理防治措施对预防和控制田间按照可持续控制的理念，生物防治在烟粉烟粉虱是很有效的，

国内外学者虱的综合防治中扮演着非常重要的角色。目前，

在烟粉虱天敌的基础研究和应用方面已经做了大量工作，并

其中病原真菌的寻找和在农业生产实践中发挥着重要作用，

应用是生物防治的主要研究内容之一。已报道的烟粉虱病原

收稿日期：2015－08－24

基金项目：江苏省高校自然科学研究面上项目（编号：14KJB210004）；江苏省南京市江宁区科技发展计划项目（编号：2015Ed01）。作者简介：王铁军（1985—），男，湖南衡阳人，助理园艺师，主要从事汤山翠谷现代农业科技园园区农业生产与科研工作。E－mail：122065151@qq．com。

通信作者：朱丽梅，博士，教授，主要从事园艺病虫害防治的教学与科研工作。E－mail：910703164@qq．com。

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在控制烟粉虱时起着重要作用。

玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）是一类较为常见的昆

曾称为玫烟色拟青霉（Paecilomycesfumosoro-虫病原真菌，

seus），属子囊菌亚门核菌纲，肉座菌目，虫草菌科棒束孢属，能寄生蜱螨目、等翅目、缨翅目、半翅目、鳞翅目、双翅目和鞘翅目等目的多种害虫。玫烟色棒束孢也是常见的土壤微

具有较广泛的地理分布和较强的生态适应能力，因此，生物，

开发和利用该类昆虫病原真菌已成为生物防治中控制害虫危

国外已筛选出对粉虱、害的一个重要手段和发展趋势。目前，

蚜虫等刺吸式口器害虫高致病力的菌株，并将其应用于大田

［6］

和温室的害虫防治。本研究从金陵科技学院园艺站采集经分离纯化得到了菌株QH1，感染真菌死亡的烟粉虱虫体，

在观察了该菌株的形态特征、菌落生长特征以及菌株显微特征的前提下，采用分子生物学手段对该菌株进行了鉴定，并初步测定了该菌株对烟粉虱的杀虫活性。11．1

材料与方法

烟粉虱病原真菌的分离纯化

将田间收集的死亡烟粉虱虫体放入70%乙醇中浸3～

［5］

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄tentpathogensofwoodyplants：diversity，ecologyandimpact［J］．FungalBiologyＲeviews，2007，21（2）：90－106．

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江苏农业科学2016年第44卷第11期

—149—

5s后，用0．5%次氯酸钠消毒3～5min，灭菌水中连续漂洗3次。用无菌操作法将病虫体移至培养基平面上，每培养皿内放3个虫体，呈三角形，每个处理3个重复，翻转培养皿，放入25℃恒温箱内培养3～4d后，在培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢子，

接种培养，反复接种纯化菌株。1．2烟粉虱病原真菌形态特征的观察

1．2．1琼脂水法用蒸馏水和2%的琼脂粉混合溶解后灭

菌备用，

试验前取少量融化的培养基滴加到载玻片中央，培养基应滴得尽可能圆且薄，

待冷却后，吸取已配制好的稀释到一定浓度的孢子液到培养基上，放入已灭菌的装有滤纸片的培养皿中保湿培养，并置于28℃的恒温箱中培养，10h后用显微镜观察，隔天观察1次，并记录孢子的萌发、菌丝体生长和产孢结构形成的过程。1．2．2

菌落形态观察将纯化的菌株接种于PDA上，于

25℃恒温箱内培养，记录在培养基上培养10d后菌落直径大小、颜色变化，并在奥林巴斯显微镜下镜检分生孢子的形状，测量分生孢子大小以及产孢细胞大小、着生方式和形态特征等情况。

1．3菌株QH1的分子鉴定

挑选菌株进行培养和DNA提取，用真菌DNA提取试剂盒提取基因组的DNA。引物为真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTAT-TGATATGC），扩增ITS1－5．8S－ITS2rDNA全序列及部分18SrDNA和28SrDNA序列。PCＲ反应体系为25μL，包括：10×PCＲ缓冲液（100mmol/LTris－HCl，500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2，1%Triton－X）2．5μL，正反向引物各1μL，PCＲ反应液2μL，10mmol/LdNTP0．5μL，0．5UTaqDNA聚合酶0．5μL，加去离子水补足25μL。PCＲ反应程序为94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收片段并连接到克隆载体pEASYT3上，挑取阳性克隆进行测序。

1．4菌株QH1对烟粉虱杀虫活性的测定

1．4．1孢子悬浮液的制备取已培养好的斜面菌种1支，加

入5mL无菌水，

轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌的50mL三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻

璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉过滤，并用无菌水冲洗滤渣2～3次，最终使滤液体积达到10mL，即得孢子悬浮液，试验

前将孢子悬液浓度调整为1．0×107

CFU/mL。

1．4．2烟粉虱杀虫活性的测定方法本试验采用浸渍法，将带有2龄烟粉虱若虫的黄瓜叶片浸入悬液中，对照浸入无菌水中，10s后取出，自然晾干。每处理为1～2片叶，每叶50～100头若虫，3次重复。置于透明的保鲜盒内。再置于（25±0.5）℃的光照培养箱中（光—暗周期14h—10h）。每日镜检并记录被分离真菌感染死亡的虫数，计算侵染率，连续观察7d。1．4．3数据统计与分析根据所观察试验结果数据计算接种后烟粉虱的死亡率，并以Abbott公式进行校正：

校正死亡率=

处理组死亡率－对照组死亡率

1－对照组死亡率×100%。2结果与分析

2．1

烟粉虱病原真菌的分离

通过保湿培养后幼虫身体被丝绒体充满和覆盖着，经分离纯化获得了菌株QH1。2．2

分离菌株的形态鉴定

在PDA培养基上，菌落生长快，

25℃下14d时菌落直径可达64．5mm，长绒毛状，形成孢子后呈肉红色、粉状、背面无

色或黄色，

一些菌株易形成分枝的粉红色孢梗束，（3～4）μm×（1～2）μm。培养10d的菌落直径达到22mm，菌落呈绒毛

状，颜色乳白色（图1），孢子形态分散或呈链状分布（图2）。分生孢子梗为瓶状结构，单生或聚集成孢梗束，壁光滑且透明，大部分为着生4个瓶梗组成轮生体的轮状分枝（图3）。瓶梗基部球状，或拟椭圆形膨大，上部细长。分生孢子柱梭

形、

光滑、透明至微淡红色，在瓶梗上形成孢子链，产孢细胞着生在柄细胞或者直接着生于菌丝上，呈烧瓶形，产孢细胞平均长为6．9μm、宽为2．5μm，孢子平均长为3．8μm、宽为2．1μm，菌丝平均宽度为2．6μm，根据上述形态学特征，分离菌株QH1初步鉴定为拟青霉属。

—150—2．3

江苏农业科学2016年第44卷第11期

序列进行系统学分析，构建进化树（图4），包括爪哇棒束孢EF990131．1、937334．1、FJ765007．1以及JF718688．1等，发现与GenBank报道的1株玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）（登录号：JF718688．1）的ITS序列表现出极高的同源性，处于系统发育树的同一分支，因此结合形态学特征，进一步确定该菌株为玫烟色棒束孢（Isariafumosorosea）。

分离菌株的测序序列比对结果分析PCＲ产物测序结果表明，该菌株ITS序列长度为550bp。

将该序列在GenBank中登录（登录号为：X2UF23JT014，序列比对号为query－6465）进行Blast同源性比较。Blast比对结果表明，其序列和GenBank库中登录的9个菌株的DNA序列为100%同源。从100个序列中选取相似性最高的9个菌株

2．4分离菌株对烟粉虱的侵染活性的差距。

本研究菌株QH1初步的生物活性测定结果表明，该菌株

处理1周后，虫体产生大量白对烟粉虱具有较强的侵染能力，

色菌丝死亡。在孢子浓度一致的条件下，分生孢子加菌丝悬浮液和分生孢子悬浮液对烟粉虱的侵染活性与菌丝悬浮液处

理的相比差异显著，而分生孢子加菌丝悬浮液和分生孢子悬但分生孢子加菌丝悬浮液对烟粉虱浮液处理间差异不显著，

说明菌株QH1可能主的杀虫活性强于单用分生孢子悬浮液，

要是通过孢子侵染烟粉虱虫体而表现出杀虫活性。本试验只

对该菌株的生物活性进行了初步研究，关于其活性、杀虫谱以及田间试验效果尚需进一步探讨。

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7

对烟粉虱的侵染活性测定结果表明，用浓度为1．0×10CFU/mL的分生孢子悬浮液、分生孢子和菌丝混合液、菌丝混

合液侵染烟粉虱2龄若虫后，烟粉虱累计死亡率见表1。不同时间的累计死亡率数据显示，孢子加菌丝处理的虫体死亡其72h和120h的平均死亡率分别为39%和62%，率较高，

2菌丝处理虫体的72h和120h死亡率分别为20%和38%，种处理方式结果有显著性差异；单用分生孢子菌悬液处理的

其72h和120h的平均死亡率分别为35%和52%，略虫体，

差于分生孢子加菌丝悬液处理的虫体死亡率，但差异不显著，与单用菌丝处理的虫体死亡率差异显著。说明菌株QH1可能主要是通过孢子侵染烟粉虱虫体而表现出杀虫活性。

表1

玫烟色棒束孢QH1的不同处理对烟粉虱

2龄若虫杀虫活性的比较

处理

分生孢子+菌丝悬液分生孢子悬液菌丝悬液

校正死亡率（%）72h0．39a0．35a0．20b

3结论与讨论

在自然界中，玫烟色棒束孢可在昆虫尸体和土壤中存活一段时间，当环境适宜时产孢，形成新的侵染，并可在自然生在害虫防治中具有重要的境和农业生态系统中形成流行病，

［5］

作用。

本研究分离的菌株QH1根据形态学特征初步鉴定为拟青霉属，通过rDNA－ITS序列和同源性检索，发现该菌株与玫烟色棒束孢相似性为100%。因此可以推断该菌株为玫烟色棒束孢。目前国内有关玫烟色棒束孢在农业害虫防治中的应用研究包括孟瑞霞等、田晶等应用其防治烟粉虱的报［6－7］［8］

，道孟豪等防治桃蚜的研究以及黄建华等测定的对小菜蛾生物活性的研究

［9］

等，但与大规模的田间应用还有一定