青蒿组织培养研究进展

王佳兴

许婷婷

嵇景双宗宪春*

渊牡丹江师范学院生命科学与技术学院袁黑龙江牡丹江157011冤

摘要本文从外植体的选择与处理尧培养条件和植物生长调节剂的种类及配比方面综述了影响青蒿组织培养的因素袁并从外植体污染尧褐变及玻璃化等方面分析了青蒿组织培养中存在的问题及对策袁以期为青蒿组织培养快速繁殖提供科学依据遥

关键词青蒿曰组织培养曰影响因素曰问题曰对策中图分类号S567.219文献标识码A文章编号1007-5739渊2019冤17-0069-02开放科学渊资源服务冤标识码渊OSID冤

渊CollegeofLifeScienceandTechnology袁MudanjiangNormalUniversity袁MudanjiangHeilongjiang157011冤

AbstractThispaperreviewedtheinfluencingfactorsoftissuecultureofArtemisiaannuaL.袁fromtheaspectsoftheselectionandtreatmentofexplants袁cultureconditions袁thetypesandproportionsofplantgrowthregulators.TheproblemsandcountermeasuresinthetissuecultureofArtemisiaannuawereanalyzedfromtheaspectsofcontamination袁browningandvitrificationoftheexplants袁soastoprovidescientificbasisfortherapidpropagationofArtemisiaannua.

KeywordsArtemisiaannuaL.曰tissueculture曰influencefactor曰problem曰countermeasure

ResearchProgressinTissueCultureofArtemisiaannuaL.

WANGJia-xingXUTing-tingJIJing-shuangZONGXian-chun*

青蒿渊ArtemisiaannuaL.冤别名黄花蒿袁是双子叶植物纲桔梗目菊科一年生草本植物遥其茎高100~200cm袁根单生袁4层袁两性花袁数量为10~30朵袁花颜色为深黄色曰果实椭圆叶纸质袁多分枝曰头状花序尧形状为球形袁总苞片层数为3~

产业化生产也有着极大的帮助遥目前袁用于青蒿组织培养的外植体有茎段尧叶片尧顶芽尧花蕾尧花枝和花序等部位遥黄红芳等[1]曾用青蒿的茎段作为外植体进行组织培养试验袁认为青蒿茎段为理想的外植体遥王梦琼[4]用青蒿的花枝尧花序和叶片作为外植体进行研究袁得出了野愈伤组织的生成能力顺序为花枝>花序>叶片袁植株再生以花枝的培养结果最佳冶的结论遥张丽珍等[3]用青蒿的幼叶作为外植体进行组培快繁试验袁结果表明袁青蒿的幼叶也可诱导出愈伤组织袁诱导率达到87%遥1.1.2

外植体的灭菌遥在接种之前必须对材料进行严格的灭菌消毒袁否则植物组织培养无法顺利进行遥灭菌消毒遵循的基本原则院要杀死附着在材料表面的微生物袁同时还要保证材料不失去活性遥要特别注意消毒时间袁材料的不同决定了时间的不同遥黄红芳等[1]在处理青蒿茎尖时袁先用自来水冲洗30min袁然后用蒸馏水冲洗袁再用吸水纸吸干表面水分后浸泡在浓度为75%的酒精中10s袁之后转入浓度为0.1%和0.2%的HgCl2溶液中浸泡10min袁其间搅拌2~3次袁最后于超净工作台中用无菌水冲洗茎段3~4次遥张丽珍等[3]在对青蒿顶芽进行处理时袁将顶芽冲洗干净后放入超净工作台袁用浓度为75%的酒精消毒30s袁再用浓度为0.1%的HgCl2消毒10min袁最后用无菌水冲洗顶芽3~5次遥穆胜玉[5]在处理青蒿的花序时袁先将花序放入浓度为10%的NaClO溶液中消毒15min袁然后用无菌水冲洗花序5次遥李飞等[6]在处理青蒿叶片与叶柄时袁先将叶片和叶柄放在自来水下冲洗20min袁然后置于超净工作台上袁用浓度为70%的酒精消毒10s尧0.1%升汞消毒8min袁之后用蒸馏水冲洗叶片和叶柄状卵形袁略扁袁瘦果小曰花果期8要11月遥作为我国传统的中药材袁青蒿的作用有很多袁主要作用是清热尧凉血尧化斑尧消暑尧泻热尧消肿尧止汗等曰从中提取的青蒿素具有减慢心率尧抑制心肌收缩力尧抗心律失常尧抑制肿瘤细胞生长等作用袁对治疗疟疾也有着良好的疗效袁并且低毒无副作用[1]遥屠呦呦及其团队受到中医典籍叶肘后备急方曳的启发袁在对中药进行大量研究的基础上创建了青蒿素提取方法袁青蒿抗疟活性化学部位在1971年10月被发现袁青蒿素在1972年11月被发现遥因为发现了青蒿素袁屠呦呦获得了2015年诺贝尔生理学或医学奖袁2016年又获得了国家最高科学技术奖[2]遥中国是世界上青蒿素原料药最大尧质量最好的国家袁仅重庆市酉阳地区的青蒿产量就约占全球产量的80%[3]遥

大量尧快速获取青蒿素含量高且稳定的青蒿的最好方法就是采用植物组织培养技术进行快繁袁这也是提高青蒿素产量的有效途径之一遥本文从外植体的选择与处理尧青蒿的器官培养途径和组织培养中存在的问题对青蒿组织培养进行了概述袁旨在为青蒿植物的组织培养快速繁殖技术提供科学依据遥

1影响青蒿植物组织培养的因素1.1外植体1.1.1

外植体的选择遥在植物组织培养研究中袁外植体的选择是首要条件袁若外植体取材方便尧取材期长袁那么在短期内就能得到大量再生植株袁对迅速建立起无菌系进而达到基金项目

黑龙江省教育厅项目渊121834冤曰牡丹江师范学院研究生科技创新项目渊kjcx2018-82mdjnu冤遥

作者简介王佳兴渊1994-冤袁男袁黑龙江穆棱人袁硕士研究生遥研究方向院

遗传育种与生物技术遥*通信作者

收稿日期2019-05-20

4~5次袁最后用灭过菌的滤纸吸干叶片和叶柄表面的水分遥精浸泡1min袁再用浓度为5%的NaClO消毒10min遥刘春朝[8]在处理不同的外植体时用的方法不同袁处理青蒿枝条时袁先将枝条放在浓度为70%的酒精中消毒30s袁再用浓度为0.1%的升汞加入2滴吐温-80消毒7min袁最后用无菌69

王梦琼[4袁7]在对试验材料进行处理时袁先用浓度为70%的酒园艺学水冲洗6遍曰处理青蒿叶片和花蕾时袁先用浓度为70%的酒精消毒30s袁然后用浓度为0.1%的升汞消毒5min袁最后用无菌水冲洗6~8次遥综上所述袁青蒿外植体灭菌过程相对简单袁但分化率很高遥1.2培养条件温度尧光照时间和光照强度等因素均对青蒿组织培养的效果有一定影响遥一般来说袁青蒿适宜的培养条件为温度渊25依1冤益[3袁5-6袁8-9]或渊25依2冤益[1袁6]尧光照12h窑d-1[1袁6袁8]或14h窑d-1[3]或16h窑d-1[5袁9]尧光照强度1500lx[1]或2000lx[3袁5-6袁9]遥研究表明袁外植体在培养初期袁尤其是在诱导愈伤组织阶段袁黑暗条件或弱光条件下培养效果较强光条件下更好[10]遥王梦琼等[4袁7]在诱导青蒿愈伤组织时袁将材料放置在24~28益条件下避光培养9d遥

1.3植物生长调节剂1.3.1植物生长调节剂对青蒿愈伤组织诱导的影响遥植物生长调节剂种类尧浓度及其配比对青蒿愈伤组织诱导率具有一定影响遥黄红芳等[1]用6-BA和IBA诱导青蒿茎段愈伤组织袁在6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L时愈伤组织诱导率最高袁达到100%遥张丽珍等[3]用相同的生长调节剂诱导青蒿叶片愈伤组织袁在6-BA0.5mg/L+IBA2.0mg/L时愈伤组织诱导率为60%遥王梦琼[4]用6-BA和2袁4-D诱导青蒿花枝与花序的愈伤组织袁在6-BA1.0mg/L+2袁4-D0.5mg/L时诱导率达到100%遥刘春朝[8]用6-BA和NAA诱导青蒿花蕾愈伤组织时袁在6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L时诱导率仅有46.4%遥穆NAA胜玉1.3.2

1.0等[9]植mg/L+2用NAA物生长袁4-D和调节剂1.02袁4-D对mg/L诱青蒿时导青蒿花序愈伤组织时袁在无诱菌苗导率生仅根为培5.56%养的影响遥遥张丽IBA珍再生的等[3]苗的生1/2MS取2~3根培cm诱养导与基高的中激素观察青蒿浓度根再关的生长生苗接种系不大情况至袁不袁添结果加入加任何发不同现激袁浓度青蒿素或者浓度较低的IBA也能诱导不定根的发生曰最适合青蒿无菌苗生根诱导的IBA浓度为0.5mg/L袁诱导率达到93%遥穆胜玉[5]在MS培养基中添加IAA和NAA进行青蒿生根培养NAA试验粗曰而的袁IAA浓度20d对于袁后浓度得出青蒿越结试大论管袁院生对苗根率青蒿生根越试影响不高管袁苗且生明根根显也影响较大的是袁明且显IAA增长浓度尧增增1/2MS+1.0大生根率等3种生根mg/L反而降培养NAA低遥基上尧李袁MS+1.0飞等[6]发现青蒿mg/L将分幼苗NAA化的在1/2MS+1.0尧丛MS+0.1生苗分mg/L别接种mg/LNAA于NAA

生根培养基上根长得最长尧最快袁并且根粗壮且密袁生长优势明显高于其他2个生根培养基遥刘春朝[8]将不同外植体诱NAA导的丛生芽接种在生根培养基中进行生根培养袁结果表明袁

根率可和达IBA到即使80%以浓度上遥低袁也均能成功地诱导丛生芽生根袁生2移栽组培苗根长1~2cm时即可进行驯化移栽遥移栽前先要进行开瓶炼苗袁炼苗结束后将根上的培养基清洗干净袁然后移栽至基质中遥在移栽初期袁为了使小苗适应外界的环境袁应提供充足的光照和适宜的空气湿度曰在移栽后期袁注意勿过旱或过涝遥李飞等[6]将已经生根的青蒿闭光炼苗5~7d后70现代农业科技圆园19年第17期栽种到珍珠岩和草木灰按2颐1的比例配制的基质中袁移栽成活率可达到90%遥刘春朝[8]将根长5cm左右的幼苗在培养室中打开瓶口炼苗3~5d后移栽于蛭石和营养土比例为1颐1的混合基质中袁成活率达到90%以上遥3青蒿组织培养中存在的问题及对策3.1

外植体污染及其防治污染是指在植物组织培养过程中袁由于细菌尧真菌等微生物的侵染袁在培养容器中滋生出大量的菌斑袁导致培养材料不能正常生长和发育的现象[11]遥外植体污染的形式有很多种袁主要分为真菌污染和细菌污染遥真菌污染是由霉菌和酵母菌引起的袁特点是易于发现袁但是污染速度快尧控制困难袁一旦发生真菌污染则损失较大曰细菌污染是由各种细菌及内生菌引起的袁特点是潜伏期较长袁有时继代几次后才能够表现出来[12]遥污染的原因多种多样袁如外植体带入尧培养基高压灭菌不到位尧培养室灭菌不彻底尧操作污染等曰在后期培养过程中袁由于人员经常出入袁也会造成污染发生遥控制外植体污染的措施包括组培室消毒尧外植体消毒尧对真菌的控制尧对细菌的控制等遥3.2

褐变及其防治褐变是指在离体繁殖过程中培养材料向培养基中释放褐色物质袁导致培养基颜色由无色变为褐色袁培养材料也随之死亡的现象[13]遥褐变在植物组织培养过程中很常见袁主要起决定作用的是植物多酚氧化酶渊PPO冤遥一般情况下袁若氧气存在于培养基中袁酚类化合物就能在PPO的催化作用下转化为醌袁醌再进行聚合反应形成黑色素袁从而导致褐变的发生[14]遥贾秀山等[15]认为袁对于青蒿叶片和茎段诱导而言袁叶片诱导分化培养的褐变较少袁茎段诱导分化培养褐化较严重袁可能是因为叶片诱导愈伤组织的PPO活性较低遥PPO的活性和总酚含量的变化规律决定了外植体褐变的变化规律袁起决定性作用的是酚类物质的含量遥控制褐变现象的措施包括合理取材尧母株和外植体预处理尧选择合适的培养基和外植体的连续转移等遥3.3

玻璃化及其防治玻璃化是植物组织培养中一种独特的生理现象袁是由于培养环境中一些物理尧化学和生化因素共同作用袁导致植物组织代谢紊乱所致遥有玻璃化现象的植株也被称为野玻璃苗冶袁其往往呈半透明状袁如同玻璃遥玻璃苗在青蒿组织培养过程中非常常见遥玻璃苗由于生理功能不同于正常苗袁所以很难移栽成活遥影响玻璃苗发生的因素有很多袁如外植体的类型尧培养基的种类与浓度尧激素的质量浓度及配比尧琼脂的浓度尧蔗糖的浓度以及温度尧光照等[16]遥解决青蒿组培苗的玻璃化现象不能只采取一种处理方式遥张丽珍等[17]发现袁在MS培养基中添加1.0mg/L6-BA尧4%蔗糖尧0.75%琼脂和0.08%碳粉袁能够使增殖系数增高尧玻璃化率降低遥刘春朝[8]在试验中发现袁顶芽和茎段等外植体诱导出的丛生芽玻璃化现象比较严重袁在顶芽和茎段的培养中袁防止玻璃化现象发生的最好方法是增加培养基中蔗糖和琼脂的浓度袁在MS培养基中附加50g/L的蔗糖或9g/L的琼脂能有效防止组织培养中出现的玻璃化现象遥

渊下转第72页冤

园艺学表1不同处理对土壤和产品硒含量的影响处理1234CK土壤硒含量试验前试验后0.480.520.480.530.480.730.480.740.480.48渊mg窑kg-1冤

处理

现代农业科技圆园19年第17期表3各处理经济效益分析肥料成本产量产值纯收益较CK依

-2-2-2-2

元窑hmkg窑hm元窑hm元窑hm元窑hm-2

16118.551833.33414666.4088.14113266.6623418.551766.67414133.310714.861133.3836118.550533.33404266.398148.14102866.63418.550500.00404000.00400581.50105300.02CK2518.9633.33297799.98295281.48注院纯N4.30元/kg袁P2O53.70元/kg袁K2O3.50元/kg袁锌硒葆40元/包袁亚硒酸钠10元/g遥富硒甜瓜8元/kg袁普通甜瓜6元/kg遥

产品硒含量0.2010.2240.0160.0140.005注院富硒甜瓜的技术指标为硒渊Se冤含量0.01mg/kg以上遥

2.3不同处理对甜瓜产量的影响从表2可知袁各施用硒肥的处理均比CK增产袁增产量大小依次为处理1跃处理2跃处理3跃处理4袁增产量分别为4.3%尧1.8%尧1.7%袁增产效果明显遥

表2

处理1234CK小区平均产量

kg155.5155.3151.6151.5148.9CK增收105300.02元/hm2曰处理3纯收益为398148.14元/hm2袁

比CK增收102866.66元/hm2遥说明2个富硒肥料品种均以喷施处理效果优于滴灌处理曰因为亚硒酸钠的成本较低袁且增产效果与锌硒葆无明显差别袁故施用亚硒酸钠的处理纯收益较高遥3结论试验结果表明袁在当地土壤条件下袁施用富硒肥料能增加土壤和甜瓜果实中硒的含量袁从而达到富硒的目的曰且采用叶面喷施的方式施用富硒肥料效果明显优于滴灌袁建议叶面喷施硒肥遥

施用富硒肥料锌硒葆和亚硒酸钠对甜瓜的增产以及土壤和甜瓜果实的富硒效果均较显著袁且2种肥料间效果差异不大曰因施用亚硒酸钠的成本投入较低袁故在本试验中施用亚硒酸钠的处理纯收益较高遥值得注意的是袁亚硒酸钠为化学制品袁使用时应严格控制用量袁以防施用过量抑制作物生长遥

[1]林杰.营养与膳食[M].2版.北京院人民卫生出版社袁2011.

[2]郭世萍袁祁磊.硒与脑功能[J].国外医学渊医学地理分册冤袁2005袁26渊1冤院8-10.

[3]颜送贵袁喻米玲袁刘茂秋.硒与富硒农产品生产技术[M].北京院中国传统文化出版社袁2015.

[4]夏美玲袁鲁秀梅袁任琴琴袁等.有机硒肥对薄皮甜瓜香气成分和营养品质的影响[J].中国瓜菜袁2018袁31渊7冤院7-12.

[5]张杨杨袁焦自高袁艾希珍袁等.土壤增施蛋氨酸硒对厚皮甜瓜生理特性和品质的影响[J].植物营养与肥料学报袁2016袁22渊2冤院476-485.

[6]食品安全国家标准食品中硒的测定院GB5009.93-2017[S/OL].渊2017-04-15冤[2019-03-21].https院//www.doc88.com/P-9357409010357.html.

[7]富硒农产品硒含量分类要求院DB45/T1061-2014[S/OL].[2019-03-21].http院//www.docin.com/P-1887058318.html.学院学报袁2006袁8渊4冤院21-24.

[10]游晓会袁马玉磊袁李小远袁等.报春花属植物组织培养研究进展渊综

述冤[J].亚热带植物科学袁2012袁41渊1冤院73-78.

[11]郭艳茹袁詹亚光.植物离体快繁中的常见问题及防治措施[J].黑龙江

农业科学袁2008渊1冤院19-21.

[12]王纪忠袁蒋婷婷袁朱丽丽袁等.植物组培技术存在的问题及解决方

法[J].现代农业科技袁2012渊20冤院166-167.

[13]贾玉娟袁丁天明袁孙向春袁等.食用玫瑰组培中外植体褐化的控制[J].

林业科技通讯袁2018渊9冤院22-25.

[14]王丽袁王万兴袁李小波袁等.植物中多酚氧化酶的研究进展[C]//中国

作物学会马铃薯专业委员会.马铃薯产业与精准扶贫2017.毕节院中国作物学会马铃薯专业委员会袁2017.

[15]贾秀山袁廖宇静袁于飞飞袁等.黄花蒿组织培养研究[J].生物技术通

讯袁2008袁19渊2冤院259-262.

[16]鲁娜袁高金秋袁王丽鑫袁等.吉林西部野生桔梗组培苗玻璃化逆转技

术研究[J].中国农机化学报袁2018袁39渊9冤院71-75.

[17]张丽珍袁杨冬业袁靳振江袁等.青蒿组织培养中克服玻璃化现象研

究[J].北方园艺袁2010渊23冤院120-122.

2200.00尧2133.34尧900.00尧866.67kg/hm2袁增幅分别为4.4%尧

不同处理的产量比较折合产量kg窑hm-2

51833.33aA51766.67bA50533.33cB50500.00dB49633.33eC较CK依增产/kg窑hm-2增幅/%2200.004.42133.344.3900.001.8866.671.7

注院表内同列不同小写字母表示差异达显著水平渊P约0.05冤袁不同大写

字母表示差异达极显著水平渊P约0.01冤遥

2冤与滴灌处理渊处理4尧5冤间产量差异达到1%极显著水平曰而喷施处理1尧2之间以及滴灌处理3尧4之间产量差异显著袁但未达到极显著水平遥说明施用硒肥的处理均比不用硒肥的处理增产显著袁硒肥喷施处理比滴灌处理增产效果显著袁而不同品种硒肥无论是喷施还是滴灌其产量差异均不明显遥

2.4不同处理对甜瓜纯收益的影响由表3可知袁施用富硒肥料虽然在一定程度上增加了肥料成本袁但由于富硒甜瓜特有的保健和抗癌功能袁其价格比普通甜瓜高2元/kg袁从而大大提高了富硒甜瓜的纯收益遥以处理2纯收益最高袁为410714.86元/hm2袁比CK增收增收113266.66元/hm2曰处理4纯收益为400581.50元/hm2袁比渊上接第70页冤

1133.38元/hm2曰其次为处理1袁为4088.14元/hm2袁比CK

CK相比产量差异均达到1%极显著水平袁喷施处理渊处理1尧

方差分析表明袁施用硒肥的各处理渊处理1尧2尧3尧4冤与4参考文献[1]黄红芳袁刘德华袁袁等.青蒿组织培养的研究[J].湖南农业科学袁2012渊7冤院115-118.

[2]袁亚男袁姜延良袁周兴袁等.青蒿素的发展与发现[J].科学通报袁2017袁62渊18冤院1914-1927.

[3]张丽珍袁徐淑庆袁杨冬业袁等.青蒿组织培养及其快速繁殖研究[J].生物学通报袁2010袁45渊3冤院48-50.

[4]王梦琼.青蒿的组织培养与植株再生[J].北京中医药大学学报袁2004袁27渊2冤院74-75.

[5]穆胜玉.青蒿的组织培养及其四倍体育种[D].重庆院西南大学袁2007.[6]李飞袁马焕新袁李忠爱袁等.青蒿组织培养再生体系的建立[J].北方园艺袁2016渊8冤院93-96.

[7]王梦琼袁崔俊茹.应用组织培养及扩繁技术迅速扩大黄花蒿优良品种的栽培[J].北京中医药袁2009袁12渊28冤院963-9.

[8]刘春朝.黄花蒿组织培养及培养物中青蒿素含量的研究[D].河南院河南大学袁2007.

[9]穆胜玉袁白志川袁宋孝霞.青蒿组织培养体系建立的研究[J].重庆科技

4参考文献72