维普资讯 http://www.cqvip.com 第３７卷Ｖ０１．３７ 第３期 Ｎｏ．３ 淡水渔业 ２００７年５月 Ｍａｖ ２００７ Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ 鲢肠道淀粉酶的分离纯化及部分性质研究 郭彩华，张希春，卢珍华，郑彩梅 （集关大学生物工程学院，福建厦ｆ１ ３６１０２１） 摘要：以鲢（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）加工下脚料为原料，分离提纯其中的淀粉酶并对其部分性质进行了研究。 结果表明经多级分离，得到了一种相对分子质量约２．１５×１０ 的淀粉酶，命名为ＳＣＩＧ１。ＳＣＩＧ１是鲢肠道淀粉酶 的一种，酶活性的最适温度为３０℃，最适ｐＨ ５．５。 关键词：鲢（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）；淀粉酶；分离纯化；酶活性 中图分类号：Ｑ９５８．８６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－６９０７一（２００７）０３－００３４－０３ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｉｌｖｅｒ Ｃａｒｐ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ＧＵＯ Ｃａｉ－ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉ－ｃｈｕｎ，ＬＵ Ｚｈｅｎ－ｈｕａ，ＺＨＥＮ Ｃａｉ－ｍｅｉ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉｍｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｆｕｊｉａｎ ３６１０２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｓｉｌｖｅｒ ｃａｒｐ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ａｎ ａｍｙｌａｓｅ ｎａｍｅｄ ａｓ ＳＣＩＧ１ ｗａｓ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｔｏ ｈｏｍｏｌｏｇｙ．ＳＣＩＧ１ ｈａｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ２．１５×１０ ． ｈｅ ｏｐｔｉＴｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ａｍｙｌａｓｅ ＳＣＩＧ１ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｏ ｂｅ ３０ ｏＣ ａｎｄ ｐＨ ５．５． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｉｌｖｅｒ ｃａｒｐ（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）；ａｍｙｌａｓｅ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ；ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ 淀粉是植物饲料中的主要成分，也是人工饵料 中最常用的安全、经济的黏结剂，但鱼类体内淀粉 酶活性较低，尤其肉食性鱼类，因而饵料中的淀粉 不能被充分利用。这不仅造成养分的浪费，影响水 质，还引起鱼类产生消化不良和肝脏疾病等现象。 在饵料中添加酶制剂，能明显提高饲料的消化率， 减少饲料对水质的污染，保证水产动物的健康¨ 。 淀粉酶是酶制剂中重要的水解酶。淀粉酶可由培养 弃肠道表面的脂肪后备用。 １．２主要仪器试剂 ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司），蛋白质相 对分子质量标准（Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），Ａｖａｎｔｉ Ｊ－１４冷冻 离心机（Ｂｅｃｋｍａｎ），Ｂｉｏ－ｐｒｏｆｉｌｅ凝胶成像仪（法国 Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ），紫外可见分光光度计（美国瓦里 安），ＷＦＪ ７２００型可见分光光度计（上海尤尼柯公 司），ＤＳ－１高速组织捣碎机（上海标本模型厂）。 １．３粗酶的制备 细菌、真菌获得或从植物提取获得，但以鲢加工下 脚料为原料分离鲢肠道淀粉酶的研究还未见报道。 本试验以鲢肠道为原料，分离提纯其中的淀粉酶并 对其部分性质进行研究，为渔用饲料酶制剂提供可 选择的淀粉酶。 将含有内容物剥弃脂肪的新鲜鲢肠道称重后切 碎，加人４倍体积的磷酸缓冲液（０．０２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．５磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液），组织捣碎机 捣碎，４℃静置２ ｈ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取 １材料与方法 １．１鲢及其处理 上清液。上清液以硫酸铵分级沉淀。紫外吸收法测 各级硫酸铵饱和度沉淀的蛋白质含量，ＤＮＳ比色 法测酶活力，根据比活力确定最适硫酸铵饱和度。 人工饲养的白鲢（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ ｍｏｌｉｔｒｉｘ）， 单尾体重在１．５ ｋｇ以上，连同内容物剥取肠道， 硫酸铵沉淀蛋白经透析后备用（粗酶）。 １．４阴离子交换分离 收稿日期：２００６—０８—１６ 资助项目：福建省自然科学基金２００６Ｊ０４１８ 第一作者简介：郭彩华（１９６３一 ），女，硕士，副教授，主要从事水产品综合利用研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｇｕｏ＠ｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期 郭彩华等：鲢肠道淀粉酶的分离纯化及部分性质研究 ３５ ＤＥＡＥ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱（１．６ ｃｍ×２０ ＣｌＴＩ），缓冲液 Ａ（０．０２ ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液，ｐＨ ７．５），缓冲液Ｂ （０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１溶于０．０２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．．５的磷酸 缓冲液）。缓冲液Ａ平衡２ ｈ，０％～１００％Ｂ梯度 洗脱，流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ。 １．５ ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ） 分离胶中丙烯酰胺终浓度１２％，标准０．７５ ｍＥ ×９０ ｍＥ×９０ ｍＥ凝胶板。恒流电泳，起始电流 １０ ｍＡ，溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶后将电流 调至１５ ｍＡ至溴酚蓝到达凝胶底部。考马斯亮蓝 染色，２５％甲醇／７％乙酸脱色。蛋白质相对分子质 量标准（１４ ４００～１１６ ０００）。 １．６蛋白质含量的测定 用紫外分光光度法和Ｌｏｗｒｙ等 的方法测定蛋 白含量。 １．７纤维素酶和淀粉酶活力测定 弱∞ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏｍ ５ Ｏ Ｏ Ｏ 比色法测定纤维素酶 和淀粉酶活力 Ｊ。绘 制标准麦芽糖曲线。分别以４ ｍＬ ０．５％的羧甲基纤 维素钠溶液、１０片０．５ ｃｍ 的滤纸及４ ｍＬ １．５％可 溶性淀粉溶液为底物。取４支试管，２支加入底 物，２支加入２ ｍＬ稀释的酶液，一起３７℃水浴预 热５ ｒａｉｎ，然后混合摇匀在３７℃水浴中保温 １０ ｒａｉｎ，取出后加入２ ｍＬ的１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ混匀， 放至室温，过滤，取滤液１ ｍＬ用ＤＮＳ显色。另取 ４支试管，同时加入２ ｍＬ稀释的酶液和２ ｍＬ的 １ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ后３７℃水浴保温，做对照组。酶活 力定义为每分钟内水解产生１ ｇ的麦芽糖为１个 酶活力单位（ｕ）。 １．８温度和ｐＨ对淀粉酶活力的影响 不同温度对酶活的影响在０．０２ ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓 冲液（ｐＨ ７．５）中测定。ｐＨ值对酶活力的影响是在 最适温度下用浓度为０．０２ ｍｏｌ／Ｌ缓冲液（ｐＨ ４．０～ １０．０）测定的，ｐＨ ４．０用磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲 液，ｐＨ ４．５～９．０用磷酸缓冲液，ｐＨ ９．５～１０．０用 碳酸钠．碳酸氢钠缓冲液。高温法终止酶反应。 ２结果和分析 ２．１淀粉酶的分离纯化结果 以纤维素酶比活力和淀粉酶比活力为分离鉴定 标准，结果表明（ＮＨ ） ＳＯ 饱和度为５０％时，淀 粉酶比活力最大（图１、图２）。 ５０％饱和度的硫酸铵沉淀蛋白经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａ－ ｒｏｓｅ分离后的结果见图３。酶活性分析表明峰１、 ２、３的蛋白均有淀粉酶活性，但峰３的淀粉酶比 一以羧甲基纤维素钠为底物 ２００ 一 １５０ 一 １００ 嫂 器 谧 ５０ ０ ０ ２０ ４０ ６０ ８０ １００ 硫酸铵饱和度（％） 图１ 纤维素酶活力和Ａ 。 值 Ｆｉｇ．１ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ａ２８０ 十淀粉酶活力－…－ｕｖ２８０ＲＥ ６０ ３５００ ３０００ ５０ ４ ４ ３ ３ ２ ２ １ １ ０５ ０ ５ ０ ５ ０ ５ ０ ５２５００ ４０ ２０００ 媲１５００ ３０ 箍１０００ ２０ ５００ １Ｏ ０ ０ ０ ２０ ４０ ６０ ８０ １００ 硫酸铵饱和度（％） 图２淀粉酶活力和Ａ。 值 Ｆｉｇ．２ Ａｍｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ａ２∞ ０ ２０ ４０ ６０ 管号 图３酶经ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析洗脱图谱 Ｆｉｇ、３ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｏｎ ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｍｓｅ ｃｏｌｕｍｎ 活力最高，达４１４．０ Ｕ／ｍｇ酶蛋白。可见鲢肠道淀 粉酶不止一种，且在阴离子交换柱上表现出离子特 性上的差异，分别在不同的时间被洗脱出来，这一 性质可以用来进行鲢肠道淀粉酶的分离和纯化。将 峰１、２、３的顶尖部分进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，结果如 图４，其中峰３显示为单一条带。可见，通过ＤＥ－ 维普资讯 http://www.cqvip.com ３６ 淡水渔业 ２００７正 ＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分离可以获得肠道淀粉酶，同时可以 获得一种电泳纯的淀粉酶，其相对分子质量约 ２．１５×１０ ，命名为ＳＣＩＧ１。 Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ １．１６×１０ 。 ＿■薯ｌ｜ ｜ ６．６２×１０ 一一 一一．。…一。。 。一 ≯毫 ｜ 。 誓 ４．５０×１０ 鬻≯ ≯ 。 ∞。 ３．５０×１０ ２．５０×１０ 一掌 ≯ ． 一 ，一 一一一…一一 一一＾一 ｜簿 ｌｌ ｜ １．８４×１０ ｊ＿萋 １．４４×１０ Ｊ～ ＿ ，、 图４鲢淀粉酶的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｆｉｇ．４ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｏｆ ｓｉｌｖｅｒ ｃａｒｐ ａｍｙｌａｓｅ 注：Ｍ 为相对分子质量，Ｍ为标准蛋白，泳道１、２、 ３为图３中的峰１，泳道４、５、６为峰２，泳道７为峰３ ２．２ 鲢肠道淀粉酶ＳＣＩＧ１的部分性质 分别对鲢肠道硫酸铵沉淀粗酶和ＳＣＩＧ１在不 同温度和ｐＨ条件下的活力进行测定，结果如图５ 和图６。可见，鲢肠道淀粉粗酶、ＳＣＩＧ１的最适温 度分别为１０℃、３０℃，而最适ｐＨ都是５．５。 １００ ８０ ６０ 饕４０ ２０ 箍 ０ ０ １０ ３０ ５０ ７０ 温度（ｏＣ） 图５ 温度对鲢肠道淀粉粗酶和纯酶的影响 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｙｌａｓｅｓ ３ 小结 经硫酸铵多级沉淀和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化淀 粉酶，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测分离效果、纯度及相对分子 质量，得到了一种相对分子质量约２．１５×１０ 的淀 粉酶，命名为ＳＣＩＧ１。分离过程表明，ＳＣＩＧ１仅是 鲢肠道淀粉酶的一种。 一 、－， 烘 靛 ｐＨ 图６ ｐＨ对淀粉粗酶和纯酶的影响 Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｙｌａｓｅｓ 鲢肠道中含有纤维素酶和淀粉酶等糖苷酶，研 究结果表明其中纤维素酶活力相对较淀粉酶活力低 （图１，图２），推测这与人工养殖鲢摄食以鱼粉、 豆粕、ｄ．淀粉为主原料的饲料适应性有关，长期的 人工饲养使得鲢肠道酶的分泌发生了变化。 研究表明淀粉粗酶和ＳＣＩＧ１的最适温度分别 是１０℃和３０℃，最适ｐＨ都为５．５，与Ｎｕｒｍａｔｏｖ 等 从枯草芽孢杆菌－７Ａ中分离提纯的ｄ－淀粉酶性 质相近。ＳＣＩＧ１的最适温度与已报道的麸皮、甘 薯、发芽黄豆中的Ｂ．淀粉酶很接近 ’ ，最适ｐＨ 与靳利娥等 已报道的发芽黄豆的Ｂ．淀粉酶的最 适ｐＨ相近。粗酶和ＳＣＩＧ１的最适温度不一致，推 测是粗酶液含有较多的离子和蛋白质成分，复杂的 外界环境使淀粉酶的最适温度与外界环境较单一的 纯酶的不一致。 参考文献： ［１］施培松，黄峰，魏开建．酶制剂在水产养殖上的应用研究概 况［Ｊ］．水利渔业，２００５，２５（４）：５～６． ［２］Ｌｏｗｒｙ ０ Ｈ，Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ Ｎ Ｊ，Ｆａｒｒ Ａ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅ— ｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９５１， １９３：２６５～２７５． ［３］Ｎｕｒｍａｔｏｖ Ｓ Ｋ，Ａｋｈｍｅｄｏｖａ Ｚ Ｒ，Ｒａｋｈｉｍｏｖ Ｄ Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉ— ｉｆｃａｔｉｏｎ．ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ０【一ａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ一７Ａ ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｎａｔ Ｃｏｍｐ，２００１，３７（４）：３６４～３６８． ［４］靳利娥，董文林．发芽黄豆Ｂ一淀粉酶的提取研究［Ｊ］．太原 理工大学学报，２００４，３５（３）：３３８～３４０． ［５］周中凯，程觉民．麸皮中Ｂ一淀粉酶提取研究［Ｊ］．粮食与油 脂，１９９７，（１）：２～５． ［６］廖爱君，陈信波，罗，等．甘薯Ｂ一淀粉酶的制备及性质 研究［Ｊ］．湖南农业大学学报，１９９８，２４（１）：１４７～１４８．
