胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定_王勇

Apr．2012，Vol．18，No．7医学综述2012年4月第18卷第7期MedicalRecapitulate，

胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定

王

中图分类号：R614；R743．31

勇，马武华※，钟

文献标识码：A

鸣，王可佳

2084（2012）07-1088-03文章编号：1006-

（广州中医药大学第一附属医院麻醉科，广州510405）

免疫组化试剂盒（即用型）

（武汉博士德生物工程有限

在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化，并能形成典型的神经细胞网络。结论该培养技术

公司）。是海马神经细胞体外培养的理想方法。

1．1．3试剂的配制种植关键词：胎鼠；海马神经元；原代培养

PrimaryCultureandIdentificationofHippocampalNeuronsofFetalRatNeuronsWANGYong，MA培养液：高糖型DMEM/F12Wu-hua，ZHONGMing，WANGKe-jia．（DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffliatedHospitalofGuang-（1∶1）培养基90%，胎牛血zhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China）

Abstract：ObjectiveToestablishabetterprimaryculturemethodfortheprimarycultureforhipocam-清10%。无血清培养液：高palneuronsofSDfetalrats．MethodsTrypsindigestionandmechanicaldissociationwereadoptedtocon-糖型DMEM/F12（1∶1）培养ductmonolayerprimaryculture．ResultsUnderthecultureconditioninvitro，fetalratneuronsshowedsimi-B272%。larformpropertiestotheircounterpartsinvivoandtypicalnervefibernetwasformed．ConclusionThis基98%，techniqueisanidealtoolforcultureinvitroforneuronsofhippocampaltissue．1．2方法

Keywords：Fetalrat；Hippocampalneurons；Primaryculture

1．2．1培养板的包被取

海马是神经元高度集中的部位，具有中枢神经配置好的50μg/mL多聚赖氨酸溶液800μL加入6

在学习、记忆、情绪反应及自主神系统的典型特性，孔培养板中，轻轻晃动，使多聚赖氨酸溶液覆盖培养

经功能等方面发挥重要作用。而海马又是癫痫、缺5%CO2培养箱内放置过置37℃，板或培养瓶底面，血/缺氧、神经变性疾病的主要病灶。神经元细胞培夜，吸弃多余的多聚赖氨酸溶液，并用PBS轻轻荡洗

神经再生、神经疾病养模型是研究神经元发育分化、两次，置培养箱中备用。［1］

的发生机制等重要的实验模型。海马细胞的原代1．2．2取材取孕18d的SD大鼠，将其颈髓横断

总体可以分为有血清培养培养方法文献报道不一，后迅速皮肤消毒，切开腹部皮肤和腹膜，将子宫完全

和无血清培养两种。有血清培养，血清可以提供细胞游离后剪开肌层和胎膜，取出胎鼠，剪断脐带后浸泡

可以促进细胞的增生和DNA生长所必需的营养成分，Hanks液的培养皿。所有胎鼠取出后，于装有D-以

的合成，但由于血清成分复杂，对于要求较高的实验研左手食指中指夹持胎鼠头部、无名指和拇指夹住躯究结果影响较大。无血清培养步骤简便，培养的细胞干，使胎鼠呈屈头状，从枕骨底沿耳上方向大鼠左右

具有较大的优越性。活性及生理特性保持良好，脑部下缘各剪一刀，即可完整掀开皮肤和颅骨盖，充

为了研究中药对海马神经元发育的影响，本课用弯头眼科镊先沿小脑下夹断脑干处，分显露大脑，

Dawley（SD）题组采用无血清培养方法，建立Sprague-再将大脑从颅腔完整取出，大脑置于改良磷酸盐缓

大鼠胎鼠的海马神经元体外培养模型，并对其进行buff-镁离子）（Dulbecco'sphosphate-冲液（不含钙、

eredsaline，D-Hanks）洗去血液和杂质，获得了一种简便可行、易于形态学观察及纯度鉴定，再置于培养

生长的培养方法。待所有大脑取完后即可开始海马的解剖，在10液中，1材料与方法倍的解剖显微镜下用显微镊在大脑背侧翻开大脑半1．1材料球，显露中间的海马，仔细将海马完整分离出来，再1．1．1实验动物孕18d（E18）SD大鼠由广州中将海马上附着的血管和脑膜剥离干净后置于放有含

D-Hanks液的培养皿。医药大学实验动物中心提供。

1．1．2主要试剂高糖型改良Eagle培养基（Dul-1．2．3接种加入2mL0．25%胰酶（胰酶的终浓

becco'smodifiedeaglemedia，DMEM）/F12（1∶1）培养37℃培养度是0．125%），混匀，瓶口用锡箔纸盖上，

B27（GIBCO公司）；台盼蓝、基、牛血清（FBS）、多聚-箱内消化10min左右，期间每5分钟轻摇数次。加

L-赖氨酸（Sigma公司）；0．25%胰蛋白酶（中国医学入同体积种植培养液终止消化，用尖头吸管轻轻吹科学院生物医学工程研究所）；神经元特异性烯醇化打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要

NSE）多克隆抗体和SABC轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；以酶（neuronspecificenolase，

1100r/min离心3min，弃去上清，用种植培养液重悬

基金项目：广东省自然科学基金（8151040701000029）200目不锈钢网，细胞，轻轻吹打，收集细胞悬液。取

摘要：目的建立较理想的SD大鼠胎鼠海马神经细胞体外原代培养方法。方法孕18d（E18）SD大鼠的胎鼠，采用胰酶消化和机械分离相结合的方法进行海马神经元的原代无血清培养。结果

广州中医药大学创新基金（2007C039）

Apr．2012，Vol．18，No．7医学综述2012年4月第18卷第7期MedicalRecapitulate，

·10·

细胞悬液0．1mL计数。根据计数结果，调整细胞终

6552

浓度为2×10个/mL。按5×10～7×10个/cm接

12h内禁止晃动。种于包被好的培养板中，

1．2．4换液12h后观察神经细胞贴壁，有明显突起生长后，将培养液换为无血清培养基（2%B27+DMEM/F12）。以后每3～4天均使用无血清培养基

在倒置显微镜下观换液。选取不同时间点神经元，

察其形态变化并进行显微摄影。

1．2．5原代培养海马神经元的鉴定将大鼠海马神

6

经元细胞终浓度（2×10个/mL）接种于铺有盖玻片并

每孔2．5mL，经多聚赖氨酸包被好的6孔培养板中，

培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定，步骤如下：①吸弃培养液用PBS洗冲洗3遍，用冷丙

3%H2O2酮固定10min。②用PBS液冲洗3遍，

（30%双氧水和纯甲醇按1∶9的溶剂比混合）封闭内

室温下10min。③PBS洗3遍，源性过氧化物酶，

0．3%Triton破膜（溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜

PBS洗3遍。④10%羊血清封闭，上的脂质）15min，

室温10min。吸弃血清（不洗）。一抗37℃反应1h（20μLNSE+1mL稀释液）；设空白对照，以PBS液代替一抗。⑤PBS洗3×5min，二抗（羊抗兔）室温

PBS洗3×5min，SABC复合物37℃、下18min，

DAB显色（5min）。镜18min）。⑥PBS洗3×5min，

下观察，自来水终止。DAB稀释度（1∶50），苏木素复

二甲苯透明20min，中性染（3min）。95%乙醇脱水，

树胶封固。风干，镜下观察。2结果

2．1相差显微镜下观察原代培养大鼠海马神经元形态学改变海马神经细胞接种时呈圆球形，相差显微镜下观察可见明显光晕，一般1～2h开始贴壁，呈扁平圆形生长，有小的集落生成。12h后大部分细胞均已贴壁，呈圆形，周围有光晕，少数细胞伸出

A）。24h后突起一般20～一至两个突起（图1-40μm，生长状况良好的细胞透亮匀质，开始铺展，突

起变粗变长，并出现末端分支，同时由于有部分已贴壁的神经元和胶质细胞的死亡，背景出现许多细小

A）。3d后突起进一步增多并形成的球形体（图1-稀疏的网状，胞体逐渐长大，光晕良好，轴突和树突

逐渐延伸，邻近神经细胞突触之间形成神经网络（图1-C）。实验中选取培养7～9d的神经细胞，此时细胞呈锥体状或多极形，胞体丰满，胞核大，仅见极少胞质，胞质透亮，胞周光晕明显，立体感强，有很强的折光性，胞体突起较长且较完整，细胞核呈圆形或卵圆形，常偏于胞体一侧，内有1～2个核仁，神经细胞突起相互交织成网状，神经细胞的纯度高，几乎难以看见多形和梭

D）。形的星状胶质细胞和小胶质细胞（图1-

A培养12h（×200）B培养24h（×100）

C培养3d（×200）

图1

D培养7d（×200）

培养的海马神经元

2．2

免疫细胞化学染色鉴定结果普通光学显微

镜下可见大部分细胞（＞90%）NSE免疫阳性颗粒位于神经细胞核周质及核突起中（呈棕黄色），细胞核

为一圆形或椭圆形淡然区，此类细胞为神经不染色，

A）；空白对照（以PBS为一抗）仅见细胞核元（图2-B）。表明本培养呈蓝色，胞体及突起均不着色（图2-方法可得到纯度较高的大鼠海马神经元细胞。

ANSE抗体染色（×400）

图2

BPBS染色（×400）

海马神经元鉴定

3

讨论

大脑海马部位的神经元高度集中，是中枢神经系统中最易受缺血/缺氧等因素影响造成损伤的部位之一，并与人体多种生理功能密切相关；海马神经元细胞培养排除了整体实验中循环、体液、内分泌及

是研究脑缺血/缺氧相血脑屏障等复杂因素的影响，

关机制的行之有效的实验模型。

神经组织的分离细胞培养是神经组织体外培养技术的一个重大发展，这一新方法使得体外纯化单

［2-3］

。神经元是一种高度分一类型神经元成为可能

化的细胞，在组织分化晚期失去增殖能力，形态上由

动物出生后很少，故对神经元胞体和突起构成，

进行分离及细胞培养要求较为特殊，其中培养条件的稳定是首要的，由于血清的成分复杂，不同批次的血清性质差异很大。此外，应用（下转第1095页）

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·1095·

3

讨论

SLE是一种复杂的自身免疫性疾病，以多种自

身抗体为特征并通过免疫复合物等途径造成全身多系统受累，并发症多，病死率高。重症SLE治疗需要应用大剂量糖皮质激素和免疫抑制剂，而这两类药物的不良反应对患者的危害很大，长期大剂量服用

糖尿病、无菌性股骨肾上腺皮质激素可引发高血压、

头坏死等并发症；合并使用免疫抑制剂并发感染而

［4］

导致患者死亡的占SLE死亡的半数以上。采用DNA免疫吸附剂进行免疫吸附是一种特异性强的高

［5］

效疗法。自1979年Terman等首次报道采用DNA免疫吸附剂血液灌流治疗1例重症SLE患者获得成功后，免疫吸附疗法日益受到临床医学的重视，免疫吸附是将具有高度特异性的抗原、抗体与吸附材料结合，制成吸附柱，采用体外循环技术，特异性地吸附体内相应的致病因子和毒性物质的技术方法。在与药物联合治疗中，增强机体对药物治疗的敏感性，

［6］

使疗效增加，不良反应减少。Hiepe等研究证实，DNA免疫吸附剂能清除SLE患者血浆中抗DNA抗体，改善病情，治疗SLE有一定效果。

本研究采用DNA免疫吸附疗法治疗的患者临床症状均得到了控制，而且治疗后血浆中抗核抗体、抗DNA抗体、免疫球蛋白IgG显著减低，补体C3升高，治疗前后比较差异有统计学意义（P＜0．01）。DNA免

疫吸附联合激素是迅速控制活动性SLE的一种有效

治疗虽可快速有效地清除自身抗体和免的治疗手段，

疫复合物，但不能抑制患者体内自身抗体的再生和负

患者反馈调节机制。单纯给予DNA免疫吸附治疗后，

体内自身抗体水平有重新升高的趋势，病情也有反复的可能。糖皮质激素和（或）其他免疫抑制剂等药物治疗可通过单个或多个靶点持续抑制自身抗体的再生

［7］

DNA免疫吸附在治疗方面也同药物治过程。同时，

疗具有协同作用，尤其对于药物治疗敏感性差的SLE

［8］

患者。综上所述，免疫吸附能有效控制SLE活动，明显改善临床症状，是治疗重症SLE的有效方法。参考文献

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10-24修回日期：2011-11-30编辑：伊姗收稿日期：2011-

檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪（上接第10页）

无血清培养基又可以有效地抑制非神经元细胞的

［4］

增殖。

传统的培养方式在实验中添加阿糖胞苷抑制神

由于阿糖胞苷的加入和去除需要经胶质细胞的成长，

反复更换培养液，变更细胞的生长环境，会对神经元的生长造成不良的影响。此外，阿糖胞苷对神经元本身

本实验采用海马神经元也有一定的抑制作用。因此，

取自孕期18d的胎鼠，因为的原代无血清培养方法，

这时期的海马细胞正处于、繁殖的阶段，取得的细胞容易在体外继续生长。实验过程中采用无血清培养基DMEM/F12+2%B27。B27是一种替代血清的添加［5］

由20多种营养成分构成，它的特点是只对不能剂，

增殖的神经元有营养作用，从而抑制胶质细胞的增殖

［6］

和生长。有文献报道，培养7～9d的海马神经元不

胞体和突触形成较为完善而仅在体外生长较为旺盛、

且对谷氨酸和缺血/缺氧损伤也较为敏感，同时其他的物质也能对此生长时期的神经元损伤起到保护性作

本实验采用培养7d的神经元进行观察。用。因此，

由于NSE是神经元分化成熟的特异性标志酶之

一，本实验应用NSE抗体的免疫组化染色方法鉴定培养的神经元及其纯度。结果显示神经细胞胞体饱满，突起粗大，胞质内颗粒明显，神经元的纯度达90%以上。

无血清体外原代神经元培养法简便可行、易于可得到纯度较高的大鼠海马神经元细胞，相对生长，

于有血清培养法具有较大的优越性，是一种较好的体外海马神经元的培养方法。参考文献

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10-03修回日期：2011-12-17编辑：楼立理收稿日期：2011-