PCR克隆

PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。

利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基（或用LB培养基）, 使得实验操作更为简单方便。

所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。

Topo TA克隆方法

Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4（Tth）连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase（Topo酶）。 Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。

Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基（或用LB培养基）等。

Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法

因为越来越多高精确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。

Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速。

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TOPO PCR表达克隆法

传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，从而影响蛋白表达和蛋白的功能。利用TOPO克隆技术把PCR产物直接

克隆至表达载体，则可避免这种情况。 Comparison of Cloning Strategies

TOPO PCR表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR扩增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR克隆表达系统。

插入介绍：

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Phusion DNA聚合酶的错配率极低，为高保真PCR建立了新标准。使用改良的lacI方法检测，Phusion DNA聚合酶的错配率比Taq DNA聚合酶低约50倍, 比Pfu DNA聚合酶低6倍（见下图）。

优点：

■ 精确：是目前市场上保真度最高的热稳定性聚合酶 ■ 强劲：更高的成功率和更少的优化步骤

■ 快速：高处理能力缩短反应时间（延伸速度15-30s/kb）

■ 高产：低酶量、高产量（50微升反应体系只需0.5-1单位酶）

■ 特异：独特的热启动修饰，实现“零时间”激活，减少了非特异性扩增和引物降解

应用：

■ 高保真PCR ■ 快速PCR ■ 热启动PCR

■ 长片段扩增（长达20kb） ■ 高通量PCR

满足高要求PCR需求的超高保真度

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