*CN102719395A*
(10)申请公布号 CN 102719395 A(43)申请公布日 2012.10.10
(12)发明专利申请
(21)申请号 201210221921.1(22)申请日 2012.06.27
(71)申请人中国医学科学院药用植物研究所
地址100193 北京市海淀区马连洼北路151
号申请人陈峰(72)发明人陈峰
(74)专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理
有限公司 12211
代理人杨慧玲(51)Int.Cl.
C12N 5/073(2010.01)
权利要求书 1 页 说明书 4 页权利要求书1页 说明书4页
(54)发明名称
斑马鱼胚胎养殖液及其配制方法(57)摘要
本发明涉及一种斑马鱼胚胎养殖液及其配制方法，培养液由氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、亚甲基兰和纯水组成。本发明的培养液模拟了斑马鱼在热带海水中的水环境，制备成实验室所需要的斑马鱼胚胎养殖液，并加入指示剂，以利于生物学试验和斑马鱼生长繁育的双重作用。
CN 102719395 ACN 102719395 A
权 利 要 求 书
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1.一种斑马鱼胚胎养殖用培养液，该培养液由氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、亚甲基兰和纯水组成，具体组分和含量如下：
2.根据权利要求1所述的培养液，该培养液的组分和含量如下：
3.权利要求1或2所述的培养液的制备方法，该方法包括如下步骤：
首先按照含量称取分析纯的NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4，然后用100-300ml的纯水溶解，然后加入所述体积的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml。
4.一种斑马鱼胚胎养殖用培养液的制备方法，该方法包括如下步骤：按照重量称取分析纯的17.5g的NaCl、0.76g的KCl、2.91g的CaCl2、2.38g的MgSO4，然后用300ml的纯水溶解，然后加入0.5ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液。
5.一种斑马鱼胚胎养殖用培养液的制备方法，该方法包括如下步骤：按照重量称取分析纯的17.0g的NaCl、0.80g的KCl、2.8g的CaCl2、2.4g的MgSO4，然后用200ml的纯水溶解，然后加入0.6ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液。
6.一种斑马鱼胚胎养殖用培养液的制备方法，该方法包括如下步骤：按照重量称取分析纯的18.0g的NaCl、0.70g的KCl、2.7g的CaCl2、2.9g的MgSO4，然后用250ml的纯水溶解，然后加入0.4ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液。
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CN 102719395 A
说 明 书
斑马鱼胚胎养殖液及其配制方法
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技术领域
[0001]
本发明属于培养液制备领域，特别是涉及一种斑马鱼胚胎养殖液及其配制方法。
背景技术
斑马鱼是二十一世纪继小鼠后又一重要的模式生物，具有繁殖能力强、体外受精
和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点。斑马鱼的心血管、血液、消化道、肝脏以及视觉与人类有许多共同特点。
[0003] 斑马鱼的基因组中约含有30000金基因，这与数日与人相差不多，而且它的许多基因与人体存在相应关系。由于人和鱼的基因及发育机制相似，近年来斑马鱼已成为研究动物胚胎发育的优良材料。[0004] 另外，斑马鱼还具独特优势：成年鱼个体小，易于饲养：常年产卵，成熟的雌鱼每隔1周可产儿百枚卵；卵在体外受精、发育，对母体无任何影响；从受精卵发育到完整的胚胎形成只需二十四小时。又由于胚胎完全透明，可视性好，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞，荧光染色或使用其他标记物可使细胞系观察得更清楚。研究者不仅能跟踪观察每个细胞的发育命运，也可观察到原肠期的细胞运动、脑区形成和心跳等胚胎发育情况，同时发育异常的突变体也很容易被鉴别出来。[0005] 斑马鱼胚胎的身体儿乎是透明的，在试验过程中，甚至可以拍摄它们心脏照片，而且可能观察到血．液在身体各部分中的流动，这些都为试验研究的进行提供了绝对便利。现在对于斑马鱼的研究已经成功地发展了突变技术，建立了斑马鱼遗传图谱，分析了有价值的突变体，成功地发展了转基因斑马鱼技术，这些都成为毒理学研究的优良资源。[0006] 斑马鱼不仅可以作为一种模式生物研究人类某些疾病起因，而且随着斑马鱼研究的深入，其必将在人类其它疾病起因、作用的靶器官和药物治疗方面获得更大的应用。由于斑马鱼的胚胎在生物学试验中具有关键性作用，因此，斑马鱼胚胎养殖液即具有维持斑马鱼的生长发育全过程，也具有良好的斑马鱼繁育维持作用。
[0007] 现有技术中有牛体细胞胚胎培养液的配方和制备方法，例如文献CN101851602A公开了一种牛体细胞克隆胚胎培养液，包括市售牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液，所述牛体细胞克隆胚胎输卵管培养液包括CaCl2·2H2O、NaCl、KCl、KH2PO4以及其余量的水，还包括激活素A。
[0008] 还有，CN101962626A中公开了一种犊牛体外胚胎培养液，所述培养液中含有半胱胺。
[0009] 目前还没有斑马鱼培养液的公布，本发明解决了斑马鱼胚胎养殖中培养液的选择问题，提供了一种能够保证斑马鱼成活率和成活状态的培养液及其制备方法。
[0002]
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种斑马鱼胚胎养殖用培养液，该培养液由氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、亚甲基兰和纯水组成，具体组分和含量如下：
[0010]
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CN 102719395 A[0011]
说 明 书
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[0012] [0013]
优选的，上述培养液组分和含量如下：
本发明还提供了上述培养液的制备方法，首先按照含量称取分析纯的NaCl、KCl、
CaCl2、MgSO4，然后用100-300ml的纯水溶解，然后加入所述体积的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml。[0015] 优选的，上述培养液的制备方法如下：[0016] 按照重量称取分析纯的17.5g的NaCl、0.76g的KCl、2.91g的CaCl2、2.38g的MgSO4，然后用300ml的纯水溶解，然后加入0.5ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液。[0017] 优选的，上述培养液的制备方法如下：[0018] 按照重量称取分析纯的17.0g的NaCl、0.80g的KCl、2.8g的CaCl2、2.4g的MgSO4，然后用200ml的纯水溶解，然后加入0.6ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液。[0019] 优选的，上述培养液的制备方法如下：[0020] 按照重量称取分析纯的18.0g的NaCl、0.70g的KCl、2.7g的CaCl2、2.9g的MgSO4，然后用250ml的纯水溶解，然后加入0.4ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液。
[0021] 本发明的培养液模拟了斑马鱼在热带海水中的水环境，制备成实验室所需要的斑马鱼胚胎养殖液，并加入指示剂，以利于生物学试验和斑马鱼生长繁育的双重作用。
[0014]
具体实施方式
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CN 102719395 A[0022]
说 明 书
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为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
[0023] 实施例1培养液1的制备
[0024] 按照重量称取分析纯的17.5g的NaCl、0.76g的KCl、2.91g的CaCl2、2.38g的MgSO4，然后用300ml的纯水溶解，然后加入0.5ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液1。[0025] 实施例2培养液2的制备
[0026] 按照重量称取分析纯的17.0g的NaCl、0.80g的KCl、2.8g的CaCl2、2.4g的MgSO4，然后用200ml的纯水溶解，然后加入0.6ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液2。[0027] 实施例3培养液3的制备
[0028] 按照重量称取分析纯的18.0g的NaCl、0.70g的KCl、2.7g的CaCl2、2.9g的MgSO4，然后用250ml的纯水溶解，然后加入0.4ml的亚甲基兰，然后加入纯水补足培养液的体积为1000ml，获得斑马鱼培养液3。[0029] 实施例4对比培养液
[0030] 对比培养液的制备方法同实施例1，其不同在于溶液中的成分和含量不同，具体的对比培养液的配方如下：
[0031]
[0032]
斑马鱼胚胎养殖实验实施例
[0034] 将斑马鱼胚胎(数量在200-300尾)置于培养液(上述培养液用体积分别为1000ml)中，在温度为28.5℃下静置培养，每个培养液分6组，3组培养正常斑马鱼胚胎，3组培养转基因斑马鱼胚胎。3天后观察胚胎的成活率和状态。
[0033] [0035]
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CN 102719395 A
说 明 书
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对于本发明的培养液，最佳的培养液组成为培养液1，其次是培养液2和3，虽然在
组分的含量上差别比较小，但是对于正常的斑马鱼胚胎和转基因的斑马鱼胚胎来说，还是有影响的，对于对比培养液1来说，虽然仅仅将硫酸镁换成磷酸二氢钾，其成活率和生长状态都产生了恶劣的影响，而对比培养液2-4来说，减少或变更培养液的组分，对斑马鱼的胚胎影响深重，甚至是无法培养的。
[0036]
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