几种激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响

几种激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响

周治东，倪庆纯，刘运忠，胡敏华*

（广州医药研究总院有限公司，国家犬类实验动物种子中心，广东广州510240）摘要：由于犬独特的生殖生理，其卵母细胞体外成熟率远远低于其它动物。本实验旨在探讨几种激素对犬卵母细胞体外成熟的影响。将采集的犬卵丘⁃卵母细胞复合体置于添加不同浓度激素成熟培养液中，对照（CK）组不添加激素，A、B、C组分别添加FSH+P4+E2量为：0.5IU/mL+2.5μg/mL+2.5μg/mL、1IU/mL+5μg/mL+5μg/mL、2IU/mL+10μg/mL+10μg/mL。通过72h体外成熟培养后核染色观察成熟率。结果显示，各种组卵母细胞发育至GV、GVBD、MI⁃

MII的比率差异不显著，其中以B组达到MI⁃MII比率最高（18.63%）。本试验表明，添加此几种体系。

关键词：犬；激素；体外成熟中图分类号：S814.1文献标识码：A

文章编码：1005⁃8567（2018）04⁃0039⁃04

浓度激素对犬卵母细胞体成熟培养没有显著促进作用，需继续探讨犬卵母细胞体外成熟培养

Theeffectofkindsofhormoneonoocytematurationof

Beagledoginvitro

GuangzhouGeneralPharmaceuticalResearchInstituteCo.，Ltd.，（NationalSeedcenterofExperimentalDog）Abstract：Duetotheuniquephysiologicalcharacter，therateofdogoocytesmaturationinvitroismuchlower

Guangzhou，Guangdong，510240，China

ZHOUZhi⁃dong，NIQing⁃chun，LIUYun⁃zhong，HUMin⁃hua*

thantheotheranimals.Thisexperimentistrytodiscoverwhetherseveralkindsofhormonecanpromotetheinvitro

maturationrateofthedogoocytes.Inthisexperiment，thecollectedoocytesweredividedintofourgroupswhichwere

supplementedwithdifferentlevelsofhormone，thatthegroupA，BandCwiththevalueofFSH+P4+E2was0.5IU/mL+2.5μg/mL+2.5μg/mL、1IU/mL+5μg/mL+5μg/mL、2IU/mL+10μg/mL+10μg/mL，respectively.Followedby72hinvitromaturation，thenuclearmaturationratewasanalysedbyHoechststaining.TheresultsshowedthattherewasnosignificantdifferenceinfourgroupsoftheoocytesdeveloptoGV、GVBD、MI⁃MIIstage.ButthequantityofgroupBoocytesdevelopedtoMI⁃MIIstagewasthehighest（18.63%）.Inconclusion，theseseverallevelsofhormonshadnosignificanteffectondoginvitrooocytesmaturationandfurtherresearchisnecessarytocarryon.

Keywords：Beagledogs；Hormone；Invitromaturation

vesicle，GV）卵母细胞，需在输卵管48～72h才能

犬排出的卵母细胞为生发泡期（Germinal发育成熟，进而具备受精能力。促排卵技术在犬上没有明显效果，且犬为非季节性单次发情动物，

收稿日期：2018⁃05⁃24

作者简介：周治东（1987⁃），男，重庆开州人，硕士研究生，主要从事实验动物繁育研究。E⁃mail：359595845@qq.com*通讯作者：胡敏华（1983⁃），男，博士，高级畜牧师，研究方向：疾病动物模型。E⁃mail：85539817@qq.com

·40·试验研究几种激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响⁃周治东，等

一年发情1~2次，要获得成熟犬卵母细胞异常困难。目前只有20%左右的犬卵丘⁃卵母细胞复合体（Cumulusoocytes⁃complexs，COCs）能成功发育至第

二次减数分裂中期（MetaphaseⅡ，MⅡ）阶段［1］

。

因此犬卵母细胞体外辅助生殖技术（如促排卵技术、卵母细胞体外成熟、受精、冷冻保存等）可为珍贵试验Beagle犬种质资源的保存与利用、基因编辑人类重大疾病Beagle犬模型的制备奠定重要技术基础。

由于犬类独特的生殖生理，其一年妊娠1~2次，平均发情间期长达6个月，在发情期7d内随时都可发生排卵，发情排卵时间难以把握［2］，排出的卵母细胞处于生发泡期，需在输卵管内完成成熟过程。尤其是目前的促排卵技术在犬上没有明显效果，卵母细胞如果通过手术从自然发情排卵的母犬上获取，需要耗费大量的人力和物力。因此大多数科研工作者从犬卵巢收集COCs再进行体外成熟。多年来科研人员尝试了各种各样的COCs体外成熟培养体系，有添加不同试剂（促性腺激素［2⁃3］、甾类［1，4］、生长因子［5］等）的、模拟输卵管内环境与犬输卵管上皮细胞共培养的［6⁃7］，甚至将COCs注入体外培养的输卵管内等［8］。尽管如此，仍只有20%左右的犬COCs能成功发育至MII阶段［1］。Yamada等［10］通过采集促排后的母犬排卵前COCs，其体外成熟率仍只有32%，而对照组为12%，是目前获得的最高成熟率，但相比其实动物卵母细胞体外成熟率，犬卵母细胞体外成熟仍存在相当的差距。

1

材料与方法

1.1

主要试剂

基础培养液TCM⁃199、胎牛血清（FetalBovine

Serum激素（，HumanFCS）均购自ChoionicGIBCOGonadotophin公司；人绒毛膜促性腺，HCG）、孕马血清促性腺激素（PregnantMareSerumGonadotropin，PMSGP4）、雌二醇）购自（ProSpecEstradiol公，E2司）；、孕卵泡刺激素激素（Progesterone（Follicle⁃

，stimulatingCysEGF）、表皮Hormone生长因，子（FSHEpidermal）、半胱氨Growth酸（CysteineFactor，，比妥钠购自）、HoechstMerck33342公司。等药品购自Sigma公司；戊巴1.2

主要仪器

立体显微镜，LeicaS8APO；荧光显微镜，NIKONFisherTi2⁃U带荧光系统；CO2培养箱1.3

卵巢采集及保存

ScientificModel3100。，Thermo犬卵巢采集自国家犬类实验动物种子中心淘汰母犬（打架、伤病、超龄种犬等），淘汰母犬分三组，1～6岁以下的发情期组、间情期组，6岁以上老年组。采集当天先用3%戊巴比妥钠按1ml/kg静脉注射麻醉母犬，待其麻醉后静脉注射10%氯化钾20～30ml，轻触动物角膜没有反射，确认母犬死亡后，手术采集卵巢囊放入盛有37℃含双抗的生理盐水中2h内运回实验室。母犬尸体用专用塑料袋包裹并贴上标签后放入专用冰箱，集中运往广东无害化处理中心处理。实验母犬的生产与使用均按广州医药研究总院有限公司动管委要求执行，实验动物生产与使用许可证号：SCXK（粤）2013⁃00071.4

卵丘⁃、卵母细胞复合体的采集

SYXK（粤）2013⁃0003。先剪去卵巢表面结缔组织和脂肪，在37℃恒温板上用穿刺法和切割法回收卵泡中的COCs，在体视镜下挑选出细胞质颜色深且均匀、紧密包裹两层及两层以上卵丘细胞、直径≥110μm的COCs用于体外成熟培养。1.5

COCs卵丘⁃的体外成熟基础培养液为：卵母细胞复合体的体外成熟培养及分组

100.1%FCS+10IU/TCM⁃199+不添mg/mL加激Cys+0.01mL素，A、Bμg/mLPMSG、C组分EGF+10别。IU添对/加照mLFSH（CKHCG+）P4组+

+1E2IU/mL+5量为：0.5μg/mL+5IU/mLμg/mL+2.5、μg/mL2IU/mL+10+2.5μg/mLμg/mL+、10100μg/mL。将COCs随机分置于μL38.5培℃养、微5%滴CO中，每个小组滴移约入15上个述，随四组后2、饱和湿度下培养72h。

几种激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响⁃周治东，等

试验研究·41·

1.6卵母细胞核成熟判定

成熟培养后，将卵母细胞移入37℃，浓度为

0.1COCs%卵放入含有，的透明质酸酶小滴中，机械地剥离卵丘细胞从而获得裸卵。将裸用毛细管轻轻吹吸4%低聚甲醛的D⁃PBS中固定20min以上，再将其移至滴有甘油和1.9μmol/LHoechest33342下观察卵母细胞的核成熟情况。犬卵母细胞体外的载玻片上，在355mm荧光显微镜核成熟按以下标准划分：GV期：未成熟或生发泡期，能看到核膜（图1A）；GVBD期：生发泡破裂（Germinal图1B）；MⅠ⁃MⅡVesicleBreak期：减数分裂中期Down，GVBD（）Meiotic，染色质扩散，MⅠ⁃MⅡ离，）排出极体，染色质凝集出现赤道面或者同源染色质分（图1C、D）。退化指未见核物质或不明确的卵母细胞。图见第52页。1.7

数据统计

试验数据经SPSS19.0进行统计、方差分析多重比较检验数据差异性，数据用平均灵敏±标准误表示，显著标准为P<0.05。

2

结果与分析

2.1

不同生殖周期、犬龄对卵丘⁃卵母细胞获取数的影响

由图2可看出，6岁以下发情期犬卵巢囊呈

淡红色，血管丰富，充实而富有弹性，并可见卵巢表面有数个增大卵泡（见图2A）。6岁以上老年犬卵巢囊呈苍白色，包裹较多脂肪且已萎缩，没有弹性（见图2B）。从表1可看出1～6岁以下发情期母犬平均每头可取得48个COCs，极显著高于1～6岁以下发情期母犬及6岁以上老年犬组，老年犬组平均每头只获取约4个COCs。图见第52页。

表1不同生殖周期、犬龄Beagle犬卵丘⁃卵母细胞采集统计

组别实验犬数（头）

总数（个）平均（个）1⁃61⁃6岁发情期104896岁以上老年犬岁间情期16330648.90±6.87A1219.13±2.72B4.00±0.58B

注：同列数据肩标不同小写字母为差异显著P<0.05，肩标相同字母为差异不显著P>0.05；大写字母为差异极显著P<0.01。下表同

2.2不同激素浓度水平对犬卵母细胞体外成熟的影响

与刚采集犬COCs（图3A）相比，将犬COCs在

体外成熟培养72h后，可见卵母细胞的卵丘细胞扩散明显（图3B），经核染色进行成熟判定，结果如表2所示，各组间核成熟达到GV、GVBD、MⅠ⁃MⅡ以上卵母细胞达到期比率差异均不显著GVBD（期以上，P<0.05），而达到各组均有MⅠ⁃MⅡ50%期比率在9.23%～18.63%之间，其中以B组最高。未见核物质或不明确的卵母细胞基本上占30%以上。图见第52页。

表2不同激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响（72h）组别卵数各减数分裂期比率（%）（个）CKMⅠ⁃MⅡ退化

A35B7010.06±4.67GV17.14±6.3443.71±8.29GVBD9.23±5.8238.44±2.56C74669.57±2.3734.31±2.2014.54±6.2629.91±1.929.72±6.2436.24±8.8638.33±7.0018.63±6.4016.45±6.0335.55±7.0634.11±3.573

讨论

3.1

不同生殖周期、犬龄对卵丘⁃卵母细胞获取量的影响

犬与人一样，卵巢功能随着年龄的增加而下

降，在国家犬类实验动物种子中心，尽管存在6岁以上的种母犬怀孕分娩情况，但其胎均产仔数明显要比6岁以下母犬低。本实验从1～6岁以下发情期母犬取得的COCs要显著高于间情期组及老年

组，平均每头母犬获得约49枚。Hewitt等［3］

发现母

犬的年龄与COCs的获取数呈现负相关，每年COCsLopes的平均获取数随母犬年龄的增长而下降。

等［4］发现6岁以下母犬所取的卵母细胞在体外培养成熟的潜力更高。李继鹏［5］也表示，发情期

COCs哺乳动物繁殖特点。的获取数要显著高于乏情期。上述结果符合3.2不同激素浓度水平对犬卵母细胞体外成熟的

影响

多年来，科研人员尝试了各种各样的犬卵母细胞体外成熟培养体系，有从基础培养液中添加

（·42·试验研究几种激素对Beagle犬卵母细胞体外成熟的影响⁃周治东，等

生长因子的［6］，模拟输卵管理内环境与犬输卵管上皮细胞、颗粒细胞共培养的［7⁃9］，将卵母细胞注入体外培养的输卵管［10］，其中以添加激素类研究较多，如添加PMSG，HCG［11］，FSH，P4［12］，E2

［2］

等。尽管方式各异，但犬COCs能成功发育

至MII阶段的只有20%左右。本实验在基础培养液中添加不同浓度的FSH、P4、E2等激素，试图从中找出最适卵母细胞体外成熟配方，但结果表明不同浓度激素对犬卵母细胞发育至GV、GVBD组MⅠ⁃MⅡ、MⅠ⁃MⅡ期比率最高，期比率差异不显著，达18.63%。实验组但其中以MBⅠPMSG⁃M［Ⅱ14］期的体外成熟液或不同体外培养温度比率稍高于添加不同浓度VE［13］、［15］的研究，但要低于添加FSH+HCG或PVA［16］。初步表明本试验中这几种激素浓度水平不能显著提高犬COCs体外核成熟率，需进一步探讨犬卵母细胞体外成熟机制机理，以提高其体外成熟效率，为犬辅助生技术及基因编辑人类疾病模式犬的研究提供技术支撑。参考文献：

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