化工原理实验教学大纲

《生物化学与分子生物学综合实验》实验教学大纲

1、课程属性：任选 2、实验属性：设课

3、学时学分：总学时30、实验学时30、学分1.5 4、实验应开学期：春季

5、先修课程：有机化学、分析化学、普学、生物化学

一、课程的性质与任务

生物化学与分子生物学综合实验的实验课是在学习生物化学与分子生物学理论课的基础上进行的一个实践性环节，本课程的教学任务是让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果和现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或进行综合性的实验，巩固和加深对生物化学与分子生物学课程中基本理论知识的理解，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、仪器仪表的使用能力、实验数据的处理和分析能力。

二、实验目的与基本要求

本实验课配合理论教学，通过实验从实践中进一步学习，掌握和运用学过的基本理论；运用生物化学与分子生物学理论分析实验过程中的各种现象和问题，培养、训练学生的分析和解决问题的能力。

学生必须完成的基本要求：准备实验，预习实验；写出预习报告，拟定记录表格；测取实验数据；整理实验数据；写出实验报告。

三、实验考核方式及办法

考核方式：考查。实验成绩评分办法：实验技能占40%，实验态度占20%，实验报告占20%，实验室常识占20%。

四、实验项目一览表

生物化学与分子生物学综合实验项目一览表

序号

1 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

蛋白质含量测定(双缩脲法)

实验项目名称

实验类型

求

设计性 必做 设计性 设计性 设计性 综合性 综合性 综合性 综合性 综合性

必做 必做 必做 必做 必做 必做 必做 必做 实验要

适用专业

时

农科类、植保、工程类 3 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 3 农科类、植保、工程类 农科类、植保、工程类 6 农科类、植保、工程类 3 农科类、植保、工程类 3 农科类、植保、工程类 6 农科类、植保、工程类 6

学

2 蛋白质含量测定(Folin酚试剂法)

蛋白质含量测定(紫外吸收法)

3 淀粉酶活力测定 4 质粒DNA的提取

5 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析 6 聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测 7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白

质分子量

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五、实验项目的具体容

实验一 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)

1、本次实验的目的和要求

学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。比较不同方法测定蛋白质含量的异同。 2、实验容或原理

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕褐色，当它与(浓度0~100μg /ml)蛋白质结合呈蓝色，颜色随蛋白质浓度的增加而加深，在595nm波长下光吸收和蛋白质浓度成正比。 3、需用的仪器和试剂

试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250 4、实验步骤

标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏； （9）回答思考题。

实验二 蛋白质含量测定(双缩脲法)

1、本次实验的目的和要求

学习和掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。比较不同方法测定蛋白质含量的异同。

2、实验容或原理

2+

碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)能与Cu产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定围符合朗伯-比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。其可测定围为1～10mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。Tris，一些氨基酸，EDTA等会干扰该测定。

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3、需用的仪器和试剂

试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、双缩脲试剂、NaOH 4、实验步骤

标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏； （9）回答思考题。

实验三 蛋白质含量测定(Folin酚试剂法)

1、本次实验的目的和要求

掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。比较不同方法测定蛋白质含量的异同。 2、实验容或原理

Folin-酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应:第一步是在碱性条件下蛋白质与CuSO4作用生成络合物，第二步是此络合物还原Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)，生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法100倍。 3、需用的仪器和试剂

分光光度计、水浴锅、试管、具塞试管、小烧杯、漏斗及架、电子天平、吸管、容量瓶、 滤纸、玻棒、研钵、离心机、离心管、Folin-酚试剂 4、实验步骤

标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

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实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏； （9）回答思考题。

实验四 蛋白质含量测定(紫外吸收法)

1、本次实验的目的和要求

学习用紫外吸收法测定蛋白质含量。熟悉分光光度计的操作。比较不同方法测定蛋白质含量的异同。

2、实验容或原理

蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基在280nm波长下具有最大的吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的吸光度是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。 3、需用的仪器和试剂

紫外分光光度计，离心机，电子天平，研钵，容量瓶，刻度吸管

4、实验步骤 （1）取4ml的豆菜提取液，在紫外分光光度计上，于280nm和260nm波长下分别测其吸光度。 （2）根据公式计算出蛋白质含量：蛋白质(μg/ml) =(1.45A280-0.74A260)×稀释倍数 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题

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应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏； （9）回答思考题。

实验五 淀粉酶活力测定

1、本次实验的目的和要求

学习酶活力测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。 2、实验容或原理

淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶。α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1，4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。它比较耐热但不耐酸，pH３·６以下可使其钝化。

β－淀粉酶从非还原端作用于α-1，4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1，６键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β－极限糊精，70℃保温15min可使其钝化。

通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15min钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。

淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3，5-二硝基水酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的3，5-二硝基水酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活力大小。

3、需用的仪器和试剂

电子天平、研钵、容量瓶、具塞刻度试管 、吸管、离心机、恒温水浴、分光光度计 1%淀粉溶液、柠檬酸缓冲液、NaOH、3，5-二硝基水酸、麦芽糖标准液（1mg/ml） 4、实验步骤 （1）酶液提取

称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml。每隔数分钟振荡1次，提取20min。3000r/min离心10min，转入上清液备用。 （2）标准曲线的制作

取25ml刻度试管7支，编号。分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、 0.7、0.9、1.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达1.0ml，再各加3，5-二硝基水酸试剂1.0ml,置沸水煮沸5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至12.5ml。混匀后用分光光度计再520nm波长下进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。

（3）α-淀粉酶活力测定

① 取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。

② 于每管中各加酶液1ml,在70℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。

③ 在对照管中加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠。 ④ 在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。

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⑤ 将4支试管置另一个40℃ 0.5℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40℃下预热的1%淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确记时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。 （4）淀粉酶总活力测定

取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入提取的酶液1ml。在对照管 加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠。4支试管中各加1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。以下步骤重复α-淀粉酶测定第⑸步的操作，同样准备测糖。

（5）样品的测定： 取步骤2，3中酶作用后的各管溶液1ml，分别放入相应的4支25ml具塞刻度试管中，各加入1ml 3，5—二硝基水酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏； （9）回答思考题。

实验六 质粒 DNA的提取

1、本次实验的目的和要求

通过该实验使学生掌握质粒培养的方法，条件（包括培养基的配制、灭菌、接种、培养）、以及提取质粒的方法。 2、实验容或原理

从大肠杆菌中提取质粒DNA的方法很多，其中的碱性SDS法提取质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异而予以分离的。在强碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性(双链解开)。由于质粒DNA是共价闭合环状超螺旋结构，变性后两条互补链不会完全分开。当溶液pH调节到中性时，质粒DNA容易复性并溶解在溶液中，而染色体DNA不容易复性，互相缠绕，在离心时极易和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。转移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的质粒DNA。

以具有质粒pETblue-2的大肠杆菌实验材料，用碱性SDS法可从该菌体中提取到质粒

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DNA，经琼脂糖凝胶电泳可以检测出。 3、需用的仪器和试剂

高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡摇床、台式高速离心机、真空干燥器、低温冰箱、恒温水浴、移液器、LB培养基、羧苄青霉素（Carb）、四环素（tet）、TE 、溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ 、溶液 Ⅲ、无水乙醇、70%乙醇 4、实验步骤

（1） 先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素（Carb,终浓度50ug/mL）和7.5uL 四环素（Tet,终浓度12.5ug/mL），然后接入一个含pETBlue－2质粒的大肠杆菌单菌落，37℃ 190r/min振荡培养过夜。

（2）将过夜培养的菌液加入1.5 mL小指管管中，4000r/min离心1分钟，吸去培养液将所有菌体细胞收集在一个小指管中。

（3）加入100μL溶液I于含菌体细胞的小指管中，旋涡振荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10分钟。

（4）加入200μL溶液II(新鲜配制)，轻轻混匀容物，将小指管置于冰上使菌液裂解变清（不可用旋涡震荡器）。

（5）加入150μL溶液III (冰上预冷),盖紧管口，轻轻混匀数次。冰上放置15分钟让质粒DNA复性（不可用旋涡震荡器）。

（6）12000 r/min离心10分钟，将上清转至另一1.5 mL小指管中。

（7）向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇 (去蛋白和脂类)，旋涡混匀，12000 r/min离心5分钟，将上清转移到另一1.5 mL小指管中。

（8）向上清中加入等体积氯仿：异戊醇(去微量酚和脂类)，旋涡混匀，12000 r/min离心5分钟，将上清转移到另一1.5 mL小指管中。

（9）向上清中加入2倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置30分钟。12000 r/min 离心10分钟，吸去上清液。

（10）用1mL 75%乙醇洗涤质粒DNA沉淀两次（每次12000 r/min 离心5分钟），吸去上清液，真空抽干或空气中干燥。

（11）加20μL TE，使质粒DNA完全溶解，－20℃保存。 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；

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（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论 （8）回答思考题。

实验七 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

1、本次实验的目的和要求

掌握电泳鉴定的基本操作技术，为从事基因工程和分子生物学研究奠定初步基础。 2、实验容或原理

琼脂糖凝胶电泳适于分离鉴定200～20000bp的核酸片段。在中性pH条件下，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后，核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。

GoldView是一种可代替溴化乙锭的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，当与DNA结合后，在紫外透射光下双链DNA呈现黄色荧光，由于未发现GoldView有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。 3、需用的仪器和试剂

琼脂糖、标准分子质量DNA 、上样缓冲液（6×loading buffer）、TAE 、GoldView 电泳仪、水平电泳槽、移液器 4、实验步骤

（1）将有机玻璃槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃槽的两端边缘封好 (一定封严，不能留缝隙)。

（2）将有机玻璃槽放置于水平位置，并放好样品梳子。

（3）将称取0.25g琼脂糖放入三角瓶中，加入25mL 1×TAE，用封瓶膜封住三角瓶的上口，在微波炉中将琼脂糖溶化。

（4）待冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液时，加入2μL GoldView核酸染料，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 (注意不要形成气泡)

（5）待胶液凝固后，取下橡皮膏，将机玻璃槽放入电泳槽。

（6）加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。 （7）加样：DNA样品中按照5：1的比例添加6×凝胶加样缓冲液(loading-buffer)，混合均匀,用移液将DNA样品加入样品孔中。(记录点样顺序及点样量)。

（8）电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，恒压80V (注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝指示剂移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。

（9）2nm紫外灯下观察DNA条带的完整性及亮度。 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项：

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（1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论； （8）回答思考题。

实验八 聚合酶链式反应(PCR)技术及电泳检测

1、本次实验的目的和要求

了解PCR实验原理及操作技术，讲授引物设计的原则，观看PCR课件

2、实验容或原理

PCR是一种在体外扩增的DNA的技术，其基本原理是通过高温使双链DNA解旋成单链，然后退火，使特征引物与互补序列配对，最后在TaqDNA聚合酶的作用下合成DNA片段，经多次循环，直至产生足够的DNA片段。Khorana等早在1971年就提出PCR概念，但直到1988年Saiki等从真细菌Thurmas aquticus rT1中开发出热稳定的TaqDNA聚合酶并实现PCR技术的完全自动化后，PCR才在生命科学研究领域被广泛用来扩增DNA片段。

PCR技术可在一个酶促反应中产生大量已知序列的DNA片段，简化了克隆、鉴定、修饰核酸等程序。正是因为具有如此快速、简便、经济、高效的特点，使得PCR技术成为分子生物学研究强有力的技术工具。

酶：来源 TaqDNA聚合酶最适温度90多度，但那时其半衰期短不足以支持30个循环。所以选择72℃作为延伸温度足以支持30个循环。

DNA片段快速扩增的方法： 即通过引物在DNA聚合酶的作用下，延伸核酸某个区域而引起的双向DNA 合成。反应物含有：

（1）模板：阳性对照 （2）Taq酶： （3）引物1 （4）引物2

（5）dNTPs ( dATP 、dCTP、 dGTP 、dTTP） （6）电极缓冲液TAE： Tris-乙酸

（7）buffer缓冲液含有：20-24个核苷酸，40%-50%的鸟苷酸、胞苷酸，以及反应所需

的MgCl2。

反应的过程： 变性 、扩增 、 复性 、 延伸

3、需用的仪器和试剂

PCR仪、水平电泳槽、恒压电泳仪、加样器、封口膜、PCR管、台式高速离心机、紫外检测仪、10×PCR反应液、、中性dNTP、引物1、引物2、DNA模板、Taq酶（2.5U/μl）、电泳缓冲液（1×TAE）、琼脂糖、Goldview、DNA Markers（标准DNA） 4、实验步骤

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PCR扩增目的基因（碱性磷酸酶AKP） （1）在0.2mL PCR管配制50μL反应体系

2.5 mmol/L dNTP Mixture 4uL 10x PCR buffer 5uL 10umol/ mL sense 2uL 10umol/ mL anti-sense 2uL 模板DNA 1uL Ex-Taq 1uL（1U） ddH2O 35uL （2）按下述程序进行扩增

1) 94℃ 预变性 5分钟 2) 94℃ 变性 1分钟 3) 55℃ 退火 1分钟 4) 72℃ 延伸 2分钟 5) 重复步骤2)一4)30次 6) 72℃延伸10分钟。 （3）琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。

配制0.8％琼脂糖凝胶30mL（1×TAE），加1.5ulGoldView。

50μL PCR扩增产物＋6uL 10×loading-buffer ＋ 6uL SYBR核酸染料，混匀，全部上样电泳，恒压80V。 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论。 （8）回答思考题。

实验九 SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

1、本次实验的目的和要求

学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、方法、并应用该方法测定蛋白质分子量。

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2、实验容或原理

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS），由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子的二硫键被还原，肽键完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质-SDS复合物；此时蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷的差异。蛋白质分子量愈大，所带的负电荷愈多，在电场中移动得越快；反之越慢。

在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移速率取决于它所带的电荷的多少、分子的大小和形状。如果用还原剂（如巯基乙醇或二硫糖醇等）和十二烷基硫酸钠（SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，并且1g蛋白质可定量结合1.4g SDS，亚基的结构呈长椭圆棒状。由于与蛋白质结合的SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量负电荷，其数值大大超过蛋白质原有的电荷量，掩盖了不同亚基间原有的电荷差异。各种蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，电泳时纯粹按亚基大小靠凝胶的分子筛效应进行分离。有效迁移率与分子质量的对数成很好的线性关系。所以，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅是一种好的蛋白质分离方法，也是一种十分有用的测定蛋白质分子质量的方法。应该注意的是，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的是蛋白质亚基的分子质量。对寡聚蛋白来说，为了正确反应其完整的分子结构，还应用连续密度剃度电泳或凝胶过滤等方法测定天然构象状态下的分子质量及分子中肽链（亚基）的数目。 3、需用的仪器和试剂

恒压电泳仪、垂直板电泳槽、注射器、加样器、烧杯、下层胶缓冲液、上层胶缓冲液、Acr + Bis 贮备液、10% 过硫酸铵、样品缓冲液（裂解液）、电极缓冲液、染色液、脱色液、1.5%琼脂、“低分子量标准蛋白”、牛血清白蛋白、鸡血清 4、实验步骤

（1）电泳槽的安装：玻璃板先用洗液浸泡，再用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，垂直地固定在两半槽之间，对角拧紧。电泳槽装好后，将溶化的1.5%的琼脂注入背面槽的小池中。

（2）样品的处理：将标准蛋白质样品及未知样品分别配制浓度为2mg/ml的溶液，溶剂为SDS样品处理液，溶解后在沸水浴中加热3-4min。冷却后待用。

（3）制胶：将胶沿玻璃壁缓慢加入已准备好的凝胶（在注胶过程中防止产生气泡），胶加到玻璃顶3cm处，立即覆盖3-5cm的水层，静止聚合40min左右。胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

分离胶聚合好之后，吸去分离胶上的水层，注入浓缩胶，同时插入梳子 。其下端应具分离胶面1cm，待胶聚合好后小心的取出梳子。

（4）点样：

标准分子量蛋白：将标准分子量蛋白溶于SDS样品缓冲液中（1-2mg/ml）在沸水浴中加热3-4nin冷却后使用。

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未知样品：将提取的未知分子量蛋白用处理标准蛋白的方法处理之。在两槽加入电极缓冲液，用微量进样器将已知分子量的标准蛋白质混合物加入到一样品槽，将未知样品加入到其他样品槽。

（5）电泳：加样接通电源后立即电泳（上槽接负极，下槽接正极），最初控制在15mA，当样品进入分离胶以后 ，电流加大到30 mA，电压恒定在80-100V之间，当指示剂染料溴酚蓝到达距分离胶底部1-2cm时可停止电泳，电泳约需3～4小时。

（6）固定和染色：电泳完毕，将胶取出，在水中浸泡10min，浸出部分SDS。后加入考马斯亮蓝R-250，染色时间以染透整个凝胶板为准，染料可重复使用。除去染色液后，用少量蒸馏水洗掉染料，然后加入脱色液，直至看出清晰的蛋白带，去掉脱色液加入固定液。

（7）脱色：用自来水冲洗凝胶上的染色液。之后放入脱色液中脱色。至能看出清晰的蛋白带测量已知与未知蛋白质的迁移率。

（8）结果与计算：

相对迁移率（Rm）= 蛋白质的迁移距离（d2）/ 指示剂的迁移距离（d1） 绘制标准曲线及测定未知蛋白分子量

以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量的对数为纵坐标。在半对数坐标纸上作图，可得一条线，然后根据未知样品的迁移率在标准曲线上就可查得相应的分子量，即为未知蛋白的分子量。 5、教学方式

学生为主，教师辅助，充分预习，完成。 6、考核要求

以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核容。 7、实验报告要求

实验报告应包括下列各项： （1）报告的题目（要简明确切）； （2）写报告人及共同测定人员的； （3）实验目的； （4）实验原理；

（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）； （6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）； （7）实验结果。明确提出本次实验的结论，用公式计算。

（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏； （9）回答思考题。

六、实验教材及主要参考资料

祥云，云贵 ，天俊主编，《生物化学实验指导》，2005年 龙翔等编著 生物化学实验方法和技术（第二版）大学

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