质粒DNA的小量制备

质粒DNA的小量制备

[摘 要] 从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，因而被各实验室广泛采用。 [关键词] 质粒dna 碱裂解法 快速提取 （一）实验目的及原理

从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的dna可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。 （二）试剂与器材

1.器材：微量移液器、1.5ml离心管、各种移液器头、台式高速离心机、高压灭菌锅、冰块

2.试剂：（1）溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta，20mmol/l 25mmtris-hcl ph8.0。（2）溶液ⅱ：0.4mol/l naoh（临用前用10mol/l naoh贮存液现用现稀解），2%sds sds（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制。（3）溶液ⅲ：60ml 5mol/l 醋酸钾，5ml冰醋酸，28.5ml h2o。（4）te缓冲液：10mmol/l tris-hcl, 1mmol/l edta（ph8.0）。（5）100%乙醇，70％乙醇。（6）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液或30％的甘油。（7）5×tris-硼酸（tbe）缓冲液。（8）5×tris-乙酸（tae）缓冲液。

3.材料：（1）含puc系列质粒的大肠杆菌；（2）琼脂糖。

（三）实验步骤

1.质粒dna的小量提取。(1)取四支1.5ml离心管，编号为1、2、3、4。用加样枪加各个溶液。(2)分别吸取200μl培养液加入这四个离心管中，在离心机（12 000r/min）离心10min，弃上清液，收集菌体。(3)在1、2、3号分别加入200μl溶液ⅰ，4号加入用等量蒸馏水代替，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮。(4)在1、2、4号加入200μl溶液ii，在3号加入（未加naoh，只加了sds）的溶液ii轻柔颠倒混匀。(5)在2、3、4加入200μl溶液iii，1号200μl的水代替溶液iii，用颠倒混匀，冰上放置15min左右，使细胞壁和蛋白质等杂质沉淀。(6)在离心机（12000r/min）离心10min。(7)吸上清液移到另一个离心管中，加入2/3原体积的异丙醇振荡混匀，在离心机（12 000r/min）离心10min，取上清液。(8)仔细吸取上清液300μl左右(注意：不要吸入沉淀和液面上漂浮的杂质)，加蒸馏水配为400μl。(9)在离心机（12000r/min）离心15min。(10)倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）。(11)室温放置或超净台上风干dna。(12)加20l灭菌超纯水。(13)质粒、bac的质量检测，于-20℃保存。 2.质粒dna的琼脂糖电泳。（1）琼脂糖凝胶的制备：称取05g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50ml tbe或tae工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。（2）胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，

将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒入有机玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×tae（tris-乙酸）或tbe（tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。（3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部。（4）电泳（带上手套操作）：加完样后的凝胶板即可通电进行电泳。（5）观察与拍照：在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。dna存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。 3.实验对照（略） 4.实验结果与分析

碱法质粒抽提当中共用到三种溶液：溶液i、溶液ii、溶液iii。溶液i的作用主要是为了控制好溶液的ph，同时更好地悬浮大肠杆菌使之不会快速沉积到管子的底部。另外在溶液i中加入高达 10 mm 的edta，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。溶液ii是用新鲜的0.4 n的naoh和2％的sds等体积混合后制备使用的。要新从浓naoh稀释制备0.4n的naoh，无非是为了保证naoh没有吸收空气中的co2而减弱了碱性。比较式样1、2

和式样3的电泳图样可以知道，如果溶液当中缺少naoh，则最终提取的质粒的质量及浓度得不到保证，在电泳当中看不到明显的dna条带。

从电泳图（图略）中可以看到，加入溶液i的式样和未加入溶液i的式样中，最终质粒dna提取的质量和浓度没有太大的变化。是否溶液i在质粒提取当中不起作用呢？我们先来分析溶液1的成分，首先对于任何生物化学反应，首要的要求是控制好溶液的ph，因此用适当浓度的和适当ph值的tris-cl溶液，是再自然不过的了。事实上，加了葡萄糖后最大的好处是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液i中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。由于本次实验是在连续的时间之内完成的，中间没有较长的时间停顿，因此用等体积的水或lb培养基来替代溶液i进行菌体悬浮是完全可以的。但是，由于没有对溶液的ph值进行调节，故在质粒的质量上可能存在某些不足，但在电泳过程中无法反映出来，需要进一步的实验证明。 [参考文献]

1.吴立柱《快速小量提取质粒dna的两种方法》[j]（《生物学通报》2004.39.10）

2.周鹤峰《碱裂解法提取质粒dna的研究》（《遵义医学院学报》2005.3）

3.吴乃虎.《基因工程原理》（上册）（北京：科学出版社 2000）

（作者单位：河南省淅川县第五高级中学）