海洋低温肌氨酸氧化酶生产菌株的筛选、鉴定及酶学特性研究

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悦澡蚤灶葬月则藻憎蚤灶早

ResearchReport

海洋低温肌氨酸氧化酶生产菌株的筛选、鉴定及酶学特性研究

2，刘迟乃玉1，

22222洋1，，于爽1，，希伦1，，李美玉1，，张庆芳1，*

（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连116622）

摘

要：为获得更适应低温环境的产肌氨酸氧化酶菌株，该研究从渤海海泥中分离、筛选高产低温肌氨酸氧化酶菌株，采用形态观

察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定，并对其所产的肌氨酸氧化酶的酶学特性进行初步研究。结果表明，共分离到产肌氨酸氧化酶的菌株8株，其中菌株LYH18的肌氨酸氧化酶活力最高，为1.65U/mL；菌株LYH18被鉴定为海泥芽孢杆菌（）；肌氨酸氧化酶的最适作用温度和pH分别为25益、8.0，在温度25～40益、pH7.0～10.0的范围内，酶活性较稳定，该酶

属于低温酶。

关键词：肌氨酸氧化酶；筛选；鉴定；酶学性质中图分类号：Q93

文章编号：0254-5071（20员9）06-0030-05

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.06.006

引文格式：迟乃玉，刘洋，于爽，等.海洋低温肌氨酸氧化酶生产菌株的筛选、鉴定及酶学特性研究[J].中国酿造，2019，38（6）：30-34.

CHINaiyu1,2,LIUYang1,2,YUShuang1,2,XILun1,2,LIMeiyu1,2,ZHANGQingfang1,2*

Inordertoobtainsarcosineoxidaseproducingstrainadaptedtolow-temperatureenvironment,ahighyieldlow-temperaturesarcosineoxi-dasestrainwasisolatedandscreenedfromBohaiSeamud,identifiedbymorphologicalobservation,physiologicalandbiochemicaltestsandmolecularbiologicaltechniques,andtheenzymaticcharacteristicsofsarcosineoxidasewerepreliminarilystudied.Theresultsshowedthat8sarcosineoxidaseproducingstrainswereisolated.Amongthem,thesarcosineoxidaseactivityofstrainLYH18wasthehighest(1.65U/ml).ThestrainLYH18wasiden-tifiedas

.TheoptimumtemperatureandpHofthesarcosineoxidasewere25益and8.0,respectively.Theenzymeactivity

sarcosineoxidase;screening;identification;enzymaticproperty

wasstableintherangeoftemperature25-40益andpH7.0-10.0,andtheenzymebelongedtolowtemperatureenzyme.

肌氨酸氧化酶（sarcosineoxidase，SOX）属于黄素蛋白氧化酶类，在自然界中分布广泛。其是酶法测定肌酐中研究较多的一种酶，可催化肌氨酸中的-甲基氧化，可偶联肌酐酶和肌酸酶降解肌酐。作为一种重要的诊断酶制剂，是测定血清或尿液中肌酐含量的关键酶之一，应用于肾脏的健康程度的诊断[1]。

为了满足工业用酶的需求，赵更锋等[2-9]已从肌氨酸氧化酶的分布、酶学性质以及分子生物学方面进行了大量研究。SUZUKIM[10]最早发现棒状杆菌属（可以产肌氨酸氧化酶，随后相继发现假单胞菌（）、链霉菌（（）、芽孢杆菌（）和节杆菌

）等微生物均可产肌氨酸氧化酶[11-16]。但目前

sp.）

一些领域的应用中受到限制。MORIN等[17]从土壤中筛选出一株产单聚体肌氨酸氧化酶的铵镨柱胞霉菌（

）M-1，测得该单聚体肌氨酸氧化酶分子质量

为48kDa，最适pH值为7.5，最适温度为40益，将该酶在45益处理10min，残余酶活力为75%。

本研究从渤海海泥中分离、筛选一株高产低温肌氨酸氧化酶菌株，采用形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定，并对其所产的肌氨酸氧化酶酶学性质进行初步研究，为肾脏疾病诊断试剂盒的研发提供优质的菌种资源。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1样品

依然存在着许多不足之处，如热稳定性普遍较差，使其在

收稿日期：2019-03-27修回日期：2019-04-09基金项目：国家高技术研究发展计划‘863计划’（No.2018YFC0311100）；国家自然科学基金（No.31500039）；辽宁省自然科学基金项目（No.20170520167，20180550728）；大连市支持高层次人才创新创业项目（No.2017RQ155）

作者简介：迟乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向为微生物工程的基础理论及应用技术研究。*通讯作者：张庆芳（1965-），女，教授，博士，研究方向为微生物工程的基础理论及应用技术研究。

研究报告

中国海泥样品：辽宁省大连渤海湾（N：39毅7忆，S：121毅41忆）。1.1.2试剂

肌酸：大连凯美化工工程配套有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）纯化试剂盒：大连宝生物有限公司；酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碘化钾、淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨、氯化钠：生工生物工程（上海）股份有限公司；所有试剂均为国产分析纯或生化试剂。1.1.3培养基[18]

富集培养基：肌酸5.0g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，海水1L，pH7.0。

分离培养基：肌酸5.0g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，碘化钾1.7g/L，淀粉10g/L，海水1L，pH7.0。

种子培养基：胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl10g/L，海水1L，pH7.0。

发酵培养基：肌酸5.0g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，海水1L，pH7.0。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

以上固体培养基中加入20g/L琼脂，培养基均在0.1MPa、121益条件下高压蒸汽灭菌20min。1.2仪器与设备

HZP-256全温振荡培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；CX21FS3显微镜：日本OLYMPUS公司；NB-1630超净工作台、UV-H232可见紫外分光光度计：菲迪康乐（广州）科学仪器有限公司；LDFX-50BI立式压力蒸汽灭菌锅：兰州方盛生物科技有限公司；APL-204电子天平、pH-3GpH计：陕西鼎盛仪器设备有限公司；MBS聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR）仪：上海普迪生物技术有限公司。1.3试验方法

1.3.1产肌氨酸氧化酶菌株的筛选

菌株初筛：取大连渤海海湾海泥10g于100mL富集培养基中，在20益、150r/min条件下振荡培养，每天测肌酸含量。待肌酸完全降解后，富集培养液经10倍梯度稀释至10-6，将稀释液涂布于固体分离培养基，25益条件下倒置培养24h，挑取变为蓝绿色的菌落进行分离、纯化。将分离得到的菌株接种到新鲜的分离培养基中，20益、150r/min条件下培养72h，测定肌酸的降解情况。

菌株复筛：将可降解肌酸的菌株接种于发酵培养基中，20益、150r/min条件下培养48h，测定其肌氨酸氧化酶活力。1.3.2肌酸降解率的测定[19]

在0.5mL的样品中，加入1mL含有1%-萘酚的1.5mol/LNaOH、0.5mL0.05%的双乙酰，显色30min，再加入3mL蒸馏水，于波长530nm处测定吸光度值。计算肌酸降解

酿造

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总第328期

·31·率，计算公式如下：

肌酸降解率=

OD530nm值（72h）-OD530nm值（0h）

OD530nm值（0h）

伊100%

1.3.3肌氨酸氧化酶活力的测定[19]

将待测菌体进行超声破壁后，于4益、8000r/min条件下离心15min，取上清酶液0.1mL于0.9mL含有0.1mol/L肌氨酸的焦磷酸钠缓冲液（pH7.4）中，37益反应10min，再加入0.25mL0.1mol/L的醋酸终止反应，并加入1.5mL含有0.04%乙酰丙酮的20%乙酸铵溶液，于37益反应40min后，在波长410nm处测定吸光度值。

肌氨酸氧化酶活力定义：在37益、pH7.0条件下每分钟分解1滋mol肌氨酸的酶量为一个酶活力单位（U）。1.3.4菌株的鉴定

形态观察：将试验菌株划线于固体LB平板上，20益恒温培养24h，观察菌株的菌落形态特征，并挑取单菌落，进行革兰氏染色，观察菌株的细胞形态。

生理生化试验[20]：对试验菌株进行V-P反应、接触酶反应、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、含碳化合物的利用等试验。

分子生物学鉴定：将试验菌株接种于富集培养基中，20益、150r/min条件下培养48h，8000r/min离心15min后弃上清，加入100滋L无菌重蒸水（ddH2O）中，混匀，沸水处理10min，12000r/min离心10min，以上清液为模板对试验菌株的16SrDNA基因序列进行PCR扩增[19]。正向引物为BSF8/20（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；反向引物为BSR1541/20（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）。采用DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，并送至北京诺禾致源生物技术有限责任公司进行测序。将测序结果提交至美国国家生物技术信息中心（nationalcenterforbiote-chnologyinformation，NCBI）的GenBank数据库中，与已知菌种的16SrDNA序列进行BLAST同源性比对，选择若干条同源性较高的模式菌株的16SrDNA序列，采用MEGA5.0软件中的邻接（neighborjoining，NJ）法构建系统发育树，确定其分类地位。

1.3.5肌氨酸氧化酶酶学性质的初步研究

最适作用温度：按照肌氨酸氧化酶活力的测定方法，分别在不同作用温度条件下（5～70益，梯度为5益），测定肌氨酸氧化酶活力，确定酶的最适反应温度；将同组实验中最高酶活力设为100%，计算相对酶活。

热稳定性：将粗酶液分别在不同温度条件下（25益、30益、40益、50益、60益、70益）处理60min，测定酶活力。

最适作用pH：分别在不同pH值条件下（4.0～11.0，梯度为0.5）测定肌氨酸氧化酶酶活力，确定酶的最适反应pH。其中pH4.0～6.0为0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH

6.0～8.5为0.1mol/L磷酸盐缓冲液；pH8.5～9.5为0.05mol/L

（·32·

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硼砂-硼酸缓冲液；pH9.5～11.0为0.05mol/L硼砂-NaOH缓冲液。

pH稳定性：将粗酶液分别于不同pH值（4.0～11.0，梯度为0.5）的缓冲液中，37益保温18h，测定酶活力。不同金属离子对肌氨酸氧化酶活性的影响：将粗酶液分别加入含有1mmol/L或10mmol/L不同金属离子（Co2+、Ca、K、Fe、Zn、Mn、Mg、Ni、Cu）的溶液中，37益保温30min，测定酶活力。将未加入金属离子的酶液活力设为100%，计算各组的相对酶活。2结果与分析

2.1产肌氨酸氧化酶菌株的初筛

通过初筛发现，27个菌落周围变成蓝绿色，其中10株菌株（LYH03、LYH09、LYH18、LYH36、LYH44、LYH45、LYH83、LYH106、LYH186、LYH221）可降解肌酸（对照菌

表2

2+

+

2+

2+

2+

2+

2+

2+

株肌酸降解率为4.5%），结果见表1。由表1可知，菌株LYH18

降解肌酸的能力最强，培养72h后，肌酸降解率达75%。

表1

菌株的肌酸降解率

Table1Creatinedegradationrateofstrains

菌株编号LYH03LYH09LYH18LYH36LYH044肌酸降解率/%5444755862菌株编号LYH45LYH83LYH106LYH186LYH221肌酸降解率/%67536668422.2产肌氨酸氧化酶菌株的复筛

将初筛获得的10株菌进行摇瓶发酵，测定其肌氨酸氧化酶活力，结果如表2所示。

菌株产肌氨酸氧化酶的酶活比较

Table2Comparisonofenzymeactivitiesofsarcosineoxidaseproducedbystrains

菌株编号酶活（/U·mL-1）

LYH030.15LYH090.67LYH181.65LYH361.02LYH440.89LYH451.12LYH830.85LYH1061.14LYH1861.21LYH2210.18由表2可知，菌株LYH18的肌氨酸氧化酶活力最高，为

1.65U/mL，与肌酸降解情况一致。因此，选取菌株LYH18为目标菌株，对其进行菌种鉴定。2.3菌株的鉴定

2.3.1形态观察

菌株LYH18的菌落与细胞形态见图1。由图1a可知，菌株LYH18在LB固体培养基上，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，易挑取；由图1b可知，革兰氏染色呈阳性，在LB固体培养基上生长3d后形成芽孢，芽孢形状为椭圆形，菌体呈杆状。这些特征表明，菌株LYH18呈现出典型的细菌特征。

在10%NaCI条件下能够生长；不能分解酪酛、明胶及淀粉；

可将硝酸盐还原为亚硝酸盐；能利用多种碳水化合物，如-半乳糖、（+）-鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、松三糖，但不能利用-木糖、棉子糖和-甘露糖；不能产吲哚。结合形态观察，根据《常见细菌系统鉴定手册》（第8版）初步鉴定菌株LYH18为芽孢杆菌属（）。

表3

菌株LYH18的生理生化特征

Table3Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsof

strainLYH18

项目接触酶V-P反应2%NaCI5%NaCI7%NaCI10%NaCI酪酛水解明胶水解淀粉水解硝酸盐还原结果+-++++---+项目-半乳糖（+）-鼠李糖纤维二糖葡萄糖蔗糖松三糖-木糖棉子糖-甘露糖吲哚结果++++++----图1菌株LYH18的菌落（a）和细胞（b）形态

Fig.1Colony(a)andcell(b)morphologyofstrainLYH18

注：“＋”表示为阳性反应；“-”表示为阴性反应。

2.3.2生理生化鉴定

[21]

参照《常见细菌系统鉴定手册》（第8版）对菌株LYH18进行生理生化试验，生理生化特征结果见表3。由表3可知，菌株LYH18在无氧条件下不能生长，接触酶试验呈阳性，V-P反应呈阴性，对氯化钠有较强的耐受性，

2.3.3分子生物学鉴定

为了进一步鉴定分离菌株LYH18，将其16SrDNA序列在GenBank数据库中进行同源性比对。结果表明，菌株LYH18与

的多个菌种的序列相似性＞97%，采用

MEGA5.0软件中的NJ法构建系统发育树，结果如图2。由

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中国图2可知，菌株LYH18与海泥芽孢杆菌（）H2同源性（99%）较高，亲缘关系最近。结合形态观

察及生理生化试验结果，将菌株LYH18鉴定为海泥芽胞杆菌（）。

图2

基于16SrDNA序列菌株LYH18的系统发育树

Fig.2PhylogenetictreeofstrainLYH18basedon16SrDNA

sequences

2.4酶学性质研究

2.4.1肌氨酸氧化酶的最适作用温度

不同作用温度条件下测定肌氨酸氧化酶活力，结果见图3。由图3可知，当作用温度在10～15益时，肌氨酸氧化酶的活性随着作用温度的升高而急剧增大；当作用温度为25益时，肌氨酸氧化酶活力最高；当作用温度在15～45益时，相对酶活力基本保持在80%以上，说明在室温条件下，该酶即可保持较高酶活，这一特点可节省能源的消耗；当作用温度高于45益后，酶活性急剧下降；当作用温度高于50益后，相对酶活＜60%。结果表明，肌氨酸氧化酶的最适作用温度为25益，该酶对高温条件比较敏感，更适合低温条件。

图3

肌氨酸氧化酶的最适反应温度

Fig.3Optimalreactiontemperatureofsarcosineoxidase

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·33·2.4.2肌氨酸氧化酶的热稳定性

肌氨酸氧化酶的热稳定性如图4所示。由图4可知，肌氨酸氧化酶在25～40益条件下处理60min后，相对酶活＞80%，保持高酶活性，说明该酶在室温条件下，较稳定；当处理温度高于40益以后，相对酶活力逐渐下降，符合海洋低温酶的特性[23]；该酶在50益处理60min后，相对酶活力急速下降，仅保留30%的相对酶活力；在60益、70益处理60min，相对酶活力均＜10%，说明该酶热稳定性较弱。

图4

肌氨酸氧化酶的热稳定性

Fig.4Thermalstabilityofsarcosineoxidase

2.4.3肌氨酸氧化酶的最适作用pH值

不同作用pH值条件下测定肌氨酸氧化酶活力，结果如图5所示。由图5可知，该肌氨酸氧化酶作用的最适作用pH为8.0，且pH值在7.5～9.0之间时，相对酶活性较高，可保持在80%以上；当pH值臆7.0或逸9.0时，相对酶活性较低。

图5肌氨酸氧化酶的最适作用pH值

Fig.5OptimalreactionpHofsarcosineoxidase

2.4.4肌氨酸氧化酶的pH稳定性

肌氨酸氧化酶的pH稳定性结果如图6所示。由图6可知，该酶在pH值臆6.0时，相对酶活＜40%；在pH值7.0～10.0之间时，酶活可保持在80%以上，较稳定；由此可以得出，在

中性至弱碱性条件下，肌氨酸氧化酶活性较高，较稳定，说明该酶耐弱碱性。

·34·

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图6

肌氨酸氧化酶的pH稳定性

Fig.6pHstabilityofsarcosineoxidase

2.4.5不同金属离子对肌氨酸氧化酶活性的影响

不同金属离子对肌氨酸氧化酶活力的影响见图7。

图7

不同金属离子对肌氨酸氧化酶活性的影响

Fig.7Effectofdifferentmetalionsonsarcosineoxidaseactivity

由图7可知，不同金属离子对酶的作用不同；同种金属离子在不同终浓度条件下对酶的作用也不同。其中Ca2+、Fe2+

、Ni2+

、Cu2+

能使该酶失活，而K+

对酶活性几乎没有影响；Co2+、Zn2+、Mg2+对酶活性有一定促进作用，其中Co2+对酶活性促进作用最强。3结论

本研究从渤海湾海泥样品中分离到一株高产肌氨酸氧化酶的菌株LYH18，肌氨酸氧化酶活力为1.65U/mL。通过形态观察、生理生化分析和分子生物学技术鉴定菌株LYH18为海泥芽胞杆菌（）。经初步

探索其产肌氨酸氧化酶的酶学性质，结果表明，该菌株所产的肌氨酸氧化酶的最适作用温度和pH值分别为25益和8.0，在温度25～40益和pH7.0～10.0范围内，酶活性较稳定，该酶属于低温酶类。菌株LYH18作为一株产肌氨酸氧化酶的新菌源，具有潜在的开发价值。参考文献：

[1]贾国辉，王耀荣.酶法肌酐检测的方法学改进探讨[J].中国冶金工业杂志，2015，32（3）：369-270.[2]赵更锋，马晓航.产肌氨酸氧化酶菌株的分离及发酵条件研究[J].微

生物学报，2003，42（2）：235-240.[3]侯赣生.肌酐检测工具酶的高效表达及其酶学性质分析[D].广州：华南理工大学，2017.[4]SUZUKIK,OGISHIMAM,SUGIYAMAM,etal.Molecularcloningandexpressionofasarcosineoxidasegenein[J].BiosciBiotechBioch,1992,56(3):432-436.[5]INOUYEY,NISHIMURAM,MATSUDAY,etal.Purificationandcharacterizationofsarcosineoxidaseof[J].Chem

PharmBull,1987,35(10):4194-4202.[6]MATSUDAY,HOSHIKAH,INOUYEY,etal.Purificationandcharac-terizationofsarcosineoxidaseof[J].ChemPharmBull,1987,35(2):711-717.[7]NISHIYAY,IMANAKAT.Cloningandsequencingofthesarcosineox-idasegenefromsp.TE1826[J].JFermentBioeng,1993,75(4):239-244.[8]HASSAN-ABDALLAHA,ZHAOGH,ESCHENBRENNERM,etal.Cloning,expressionandcrystallizationofheterotetramericsarcosineoxi-dasefrom[J].ProteinExpresPurif,2005,43(1):33-43.[9]LEES,JIAB,PHAMP,etal.Architectureandcharacterizationofsarco-sineoxidasefromKOD1[J].Extremophiles,2012,16(1):87-93.[10]SUZUKIM.Purificationandsomepropertiesofsarcosineoxidasefromsp.U-96[J].JBiochem,1981,89(2):599-607.[11]刘辉，孙桂琴，马晓航，等.芽胞杆菌BSD-8肌氨酸氧化酶的纯化与

性质[J].生物工程学报，2010，26（3）：335-340.[12]KAPLANA,NAUGLARD.Creatininehydrolaseandcreatineamidino-hydrolase:I.Presenceincell-freeextractsof[J].MolCellBiochem,1974,3(1):9-15.[13]IDAK,MORIGUCHIT,SUZUKIH.Crystalstructureofheterotetramericsarcosineoxidasefromsp.U-96[J].BiochemBioph

ResCo,2005,333(2):359-366.[14]NAGATAK,SASAKIH,HUAM,etal.Crystalstructureofmonomericsarcosineoxidasefromsp.NS-129revealsmultipleconformationsattheactive-siteloop[J].PJpnAcadB-Phys,2005,81(6):220-224.[15]KIMJM,SHIMIZUS,YAMADAH.Sarcosineoxidaseinvolvedincreatininedegradationinsubsp.J9andsp.J5andJ11[J].JAgrChemSocJpn,1986,50(11):2811-2816.[16]KIMJM,SHIMIZUS,YAMADAH.Crystallizationandcharacteriza-tionofsarcosineoxidasefromsubsp.[J].AgrBiolChem,1987,51(4):1167-1168.[17]MORIN,KAWAKAMIB,HYAKUTOMEK,etal.CharacterizationofbetainealdehydedehydrogenasefromM-1[J].JAgrChemSocJpn,1980,44(12):3015-3016.[18]郭康平.sp.BSD-8肌酐降解酶系的研究[D].杭州：浙江大学，

2008.[19]孙桂芹.sp.BSD-8肌氨酸氧化酶的研究[D].杭州：浙江大学，2004.[20]任楠楠，迟乃玉，张庆芳.海洋低温甾醇酯酶菌株的筛选鉴定及其酶

学特性研究[J].中国酿造，2019，38（1）：37-41.[21]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：

43-65.