放牧压力下大针茅群体遗传多样性的RAPD分析

干　旱　区　资　源　与　环　境

JournalofAridLandResourcesandEnvironment

Vol.19　No.5

Sep.2005

文章编号:1003-7578(2005)05-185-05

3

放牧压力下大针茅群体遗传多样性的RAPD分析

张红梅1,2,赵萌莉2,李青丰2,韩冰3,杨洁4,苏佳楼5,张春江5

(1.浙江省嘉兴市农业科学院嘉兴314016;2.内蒙古农业大学生态环境学院呼和浩特010018;

3.内蒙古农业大学生物工程学院010018;4.内蒙古大学生命科学院010021;5.内蒙古锡林浩特草原站026000)

　　提　要:大针茅(Stipagrandis)是我国北方典型草原上最重要的饲用植物之一,分布广,数量大,是优势种之一。本研究应用RAPD技术检测大针茅植物不同放牧压力下群体的遗传多样性,探索放牧强度与遗传分化的相互联系。在放牧和对照群体中,利用18个有效引物共获得了129个位点,其中多态性位点为105个,占81.40%,说明个体发生较高的遗传变异。两个群体都具有特异性位点,说明放牧压力导致某些位点发生了变化,但遗传变异主要存在于群体内(遗传一致度为90.43%)。　　关键词:大针茅;RAPD;遗传多样性　　中图分类号:Q943　　　　　　文献标识码:A大针茅是亚洲中部草原亚区特有的蒙古草原种[1],隶属于针茅属光芒组(Sect.Capillatae),为多年生、旱生、密丛型禾草[2]。以大针茅为建群种或优势种的大针茅草原,是欧亚草原区中部区特有的一种丛生禾草草原。大针茅群落在内蒙古草地所占的面积为4309.21万hm2[3],这一地区不仅是内蒙古主要的畜牧业基地,又是京津地区的主要绿色屏障,具有不可忽视的生态和经济意义。长期以来,由于过牧和不合理的农垦活动,使草地日趋退化,一些优质饲用植物群系衰退或消失,大针茅衰退也较为普遍。RAPD标记在分子生态学中的应用主要集中在研究分类学上的同一属的不同种之间,同一种内的不同亚种之间以及同一种内不同无性系或群体之间分子的遗传变异,以及这些分子变异与其生境之间的联系[4-7]。本研究以中国科学院植物所草原定位站的未放牧样地和放牧样地的大针茅为对象,利用RAPD技术检测大针茅植物不同群体的遗传多样性,探索放牧强度与其遗传分化的相互关系。研究结果将对大针茅在放牧压力下的适应潜力和发展趋势有一个较全面的认识,对制定合理的草地利用和管理措施及退化草地的恢复与重建具有指导意义。

1　材料与方法

1.1　研究地区自然地理条件概况

研究地区位于内蒙古定位站(中国科学院草原定位点)未放牧样地(1979年围封)和放牧样地(1999年围封)。样地设在锡林河南岸、益和乌拉分场葛根萨拉以南和依和都贵北面的低丘宽谷地带,海拔1200—1250m,≥10℃以上的积温为2200,年降水量为350mm,土壤为典型栗钙土[8]。

未放牧样地(1979年围封)约有86种植物,其中常见者约45种左右。以根茎禾草未放牧样地占显著优势,其次为大针茅、恰草、冰草和羽茅等。这些禾草构成了群落的主体,其中重量比率达60%以上。禾草以外的杂类草种类约75种,如麻花头、扁蓿豆、柴胡、冷蒿、凤毛菊等。未放牧样地自1979年围封以来一直未加利用,属于草原生态系统的顶级群落。

3收稿日期:2005-03-03。

基金项目:国家自然基金(30440051)及内蒙古科技攻关项目资助。

作者简介:张红梅(1976-),女,硕士,浙江嘉兴人,主要从事植物遗传多样性的研究。通讯联系作者:赵萌莉(Email:menglizhao@yahoo.com)。

・186・干　旱　区　资　源　与　环　境第19卷

放牧样地(1999年围封)与未放牧样地相邻,植被状况相似。但因长期放牧后才围封,未放牧样地、羽茅、冰草等禾草均有所下降,苔草、葱属植物增多。植物密度、高度都明显下降,植物种类相对于未放牧样

地较少。轻度退化,1999年围封后未加利用。

8月下旬采集大针茅叶片做RAPD分析。两个样地的大针茅群体按同一方向随机采取15株,两株之间至少相距10m,且株丛大小一致,剪取鲜嫩叶片用冰盒带回实验室,贮存于-20℃的冰箱中备用。1.2　细胞总DNA的提取和检测采用改进的CTAB法提取细胞总DNA,并对细胞总DNA进行二次提取,获得较纯的DNA。采用电泳检测和紫外吸收检测来估测DNA的浓度及纯度。1.3　引物的筛选及反应体系

表118个有效引物的编号及序列选2个DNA样品做模板,对Sangon

Tab.118primersanditssequenceusedinthisstudy公司的106个引物分别进行PCR扩增筛

引物编号对应序号5’-3’序列引物编号对应序号5’-3’序列选,筛选出18个有效引物(表1)。PCR扩增程序为94℃预变性3min,94℃变性

1min,37℃复性1min,72℃延伸1.5min,设45个循环,最后72℃保温5min;反应

μμL(10mmol/L)总体系为25L,包括0.2

μL(10mmol/L)Mg2+,0.5μLdNTPs,2.0

(100pmol/μL)引物,模板DNA80ng,Taq

μ酶1.0U,2.5L10×buffer缓冲液,其余部分用灭菌超纯水补平。1.4　PCR扩增产物的检测S02S41S44S46S49S55S316S318S320B02D01D04D06D09D15X16X18X20TGATCCCTGGACCGCGAAGGTCTGGTGAGGACCTGAACGGCTCTGGAGACCATCCGTGCTCTCTGTTCGGGACTAGGTGGCCCAGCTAGA

S441S444S446S447S453S454S458S458S460

O01O04O06O07O13O14O18O19O20

GGCACGTAAGAAGTCCGCTCCCACGGGAAGCAGCACTGACGTCAGZGTCCAGCATGGCTCCTCGCTATCCGGTGCACGTTACACACGCTT

采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增产物加4ul上样缓冲液,另取1ulLambda双酶切

DNA(ECORI+HindIII)作为标准,电泳液为0.5×TBE缓冲液,电压为110V,电泳1.5-2h后,在紫外分析仪上检测并照相。

1.5　RAPD数据的统计分析方法

每个样品的扩增产物电泳分离谱带在某一位点上按有或无记录,存在时赋值为1,否则为0。统计各引物检测各群体的多态位点比率,并根据Kongkiatngam[9]等的方法估计等位基因的频率,应用Nei指数和Shannon信息指数估算群体的遗传变异及群体间的遗传距离。1.5.1　等位基因频率

按照Nei的定义,一个二倍体居群中的基因位点A的指定的等位基因(i)的频率(qi)的计算公式为[10]qi=(2nii+∑nij)/(2N)(i≠j)

nii-具有纯合aiai基因型的个体数;nij-具有杂合aiaj基因型的个体数;N-个体总数。1.5.2群体的基因多样性和遗传分化系数(GST)

Nei[11]将总群体的基因多样性(HT)分解为群体内基因多样性(HS)和群体间基因多样性(DST):HT=HS+DST;GST=DST/HT

1.5.3群体间的遗传距离和样品间的遗传一致度

Nei定义遗传距离为:D=-logeI或D=-ln(I)。

根据Nei的方法计算样品间的遗传一致度。计算公式为I=2Nxy/(Nx+Ny)式中I-遗传一致度;Nx-X样品出现的带数;Ny-Y样品出现的带数。1.5.4Shannon信息多样性指数　　H=-ΣPilog2Pi

式中,Pi:等位基因频率;H可以估算两种水平的多样性:群体内的多样性(HPOP)和总的多样性(HSP)。

采用加拿大Ualberta大学的软件Popgen32计算遗传距离和遗传多样性指数,并进行聚类分析。

2　结果与分析

2.1　DNA的提取纯化

第5期张红梅等　放牧压力下大针茅群体遗传多样性的RAPD分析・187・

使用改进的CTAB法所提取的22个样品的DNA均能得到较清晰的迁移条带。用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测,所提取DNA呈一条亮带,说明DNA样品很少受到剪切或降解。用紫外分光光度计检测所得的DNA纯

度(以OD260与OD280的比值来估测DNA样品的纯

图1引物B02对大针茅两个群体的扩增

Fig.1RAPDprofilesamplifiedwithSongongprimerB02度)大部分都集中在1.6-1.9的范围,证明DNA较纯。

结合以上两种方法所检测到的DNA浓度,将各样品稀释为40ng/μl的工作液(见图1)进行PCR扩增,均

可得到较好的可重复结果。

2.2　放牧对大针茅遗传多样性的影响

表218个引物扩增的放牧和对照样地大针茅群体的多态性条带

Tab.2Numbersofamplificationproductsgeneratedwith18arbitraryoligonucleotideprimersinStipaGrandis引物

B02D01D04D06D09D15X16X18X20001004006007013014018019020

在2个群体22个个体中,用18个有效引物扩增出129条清晰谱带,代表129个位点,平均每个引物扩增出7.2条带,多态性条带为105条,总的多态位点比率为0.8140。其中放牧样地总条带为119条,81条为多态的,多态性带比率为0.6279;未放牧样地总条带为121条,多态性带为83条,多态性比率为0.6434(表2)。2.3　等位基因频率

经电泳分离后的RAPD谱上一些位点的频率变化在两群体之间是有规律可循的。2个群体的RAPD谱之间有着大量共同的扩增片段,也存在着差异片段(表3)。未放牧样地群体共有特异性位点14条,除D01-1625,D04-794,D06-2345,O13-4268、2400、1904,O20-1904这6个位点外,其余的特异性位点的等位基因频率都很小(0.047,0.095),证明在未放牧样地群体中,具有特异性位点的个体不多。放牧样地群体特异性位点数与未放牧样地群体相差无几,共有12个位点,与未放牧样地群体类似,等位基因频率大于0.1的位点只有O14-1652,O18-1285,O19-1961、1182,O20-1330。

表3

样　地放牧样地

位点

X16-1382O14-3852O18-1285B02-2727

扩增条带多态性条的总数

11956610487877667787129

带总数

85366835777636768410581.40

每个引物检出的多群体

放牧未放牧态性条带百分率(%)

5315282577632376728162.79

6526652467653434638364.34

72.7355.5660.00100.00100.0080.0075.0062.50100.0087.50100.0085.7150.00100.00100.0085.71100.0057.1481.40

合计多态条带百分率(%)

未放牧样地群体和放牧样地群体的特异性位点

位点

X18-1751O14-1652O19-1961D01-1625D09-976O13-4268O20-1904

Tab.3Rarelociingrazingandungrazingpopulation基因频率

0.0470.0470.1470.0470.2620.0470.047

基因频率

0.2020.2020.2020.1470.1470.3970.147

位点

X20-1623O14-1284O19-1182D04-1500O04-3030O13-2400

基因频率

0.0470.0470.1470.0470.0470.699

位点

O13-4600O18-1932O20-1330D04-794O06-2900O13-1904

基因频率

0.0960.0470.6991.0000.0960.147

未放牧样地

D06-2345O07-1935O19-1764

2.4　根据估测等位基因频率计算的Shannon多样性指数

为了准确地估测大针茅各群体的遗传分化,本文根据Konghiatngamd等的方法估测了大针茅群体内各位点上的等位基因的频率,应用Shannon信息指数估计了大针茅群体内和群体间的遗传变异。根据统计结果,放牧样地、未放牧样地群体内的遗传多样性指数分别为0.3279、0.3164。比较而言,两群体的遗传多样性相差不多。遗传多样性指数在群体内比率为0.8296,群体间的比率仅占0.1704。说明遗传多样性大部分存在于群体内(表4)。2.5

Nei指数估测放牧样地和对照群体基因多样性与群体间遗传分化指数

遗传多样性指数反映了群体内和群体间遗传分化的程度和分化的状况。由Nei指数估算的2个群体

・188・干　旱　区　资　源　与　环　境

表4根据Shannon信息指数估测遗传多样性在群体内和群体间的分布

Tab.4Estimatedofgeneticdiversityandpartitioningofthegeneticdiversityintowithinandbetweenpopulationsfor18primersbyShannonindex引物

B02D01D04D06D09D15X16X18X20O01O04O06O07O13O14O18O19O20

第19卷

群体

放牧样地未放牧样地

0.24630.18550.08360.46900.20400.49610.15150.29000.48690.50840.40630.27650.16450.29790.44720.41380.42640.15940.3279

0.24310.30310.15260.57250.60460.26930.21760.28190.46000.44120.41680.33660.16790.32620.21370.19710.28700.22910.3164

HSP0.36260.27770.26200.55980.51570.43280.23670.31750.47580.49390.44210.38830.17020.45200.42830.33950.38310.39610.3884HPOP0.24420.24430.11810.52080.40430.38270.18460.28600.47350.47480.41160.30660.16620.31210.33050.30580.35170.19430.3222HPOP/HSP0.67350.87970.45080.93030.78400.88420.77990.90080.99520.96130.93310.78960.97650.69050.77170.90070.91800.49050.8296

(HSP-HPOP)

/HSP0.32650.12030.54920.06940.21600.11580.22010.09920.00480.03870.06690.21040.02350.30950.22830.09930.08200.50950.1704

平均

的基因多样性指数分别为:放牧样地0.2189,未放牧样地0.2085(表5)。群体内遗传多样性的平均值为0.2137,而群体间的遗传多样性仅有0.0423,如由X20和O07引物扩增结果所得群体间遗传多样性分别为0.0002和0.0008。遗传分化系数(GST)的值也很小,仅为0.1650。遗传一致度(I)为0.9043。说明两群体的遗传变异主要发生在群体内,与Shannon指数估测结果一致。

表5根据Nei指数估测遗传多样性在群体内和群体间的分布Tab.5Estimatedofgeneticdiversityandpartitioningofthegeneticdiversityintowithinandbetweenpopulationsfor18primersbyNei’sindex

引物

B02D01D04D06D09D15X16X18X20O01O04O06O07O13O14O18O19O20

群体

放牧样地未放牧样地

0.16580.12670.05020.31880.14040.34490.08500.18440.32320.34710.26860.19420.10860.20380.28660.26930.27730.10630.2189

0.15600.20450.09500.338740.41680.17930.14450.19700.31060.29410.27220.21430.10280.21100.13710.12130.17610.15190.2085

HT0.24300.18400.17410.37750.34230.28760.13900.21170.31710.33610.28410.26470.10650.29190.28070.21180.23770.26930.2560

HS0.16090.16560.07260.35310.27800.26210.11470.19070.31690.32060.27040.20430.10570.20740.21190.19530.22670.12910.2137

DST0.08210.01840.10150.02440.06430.02550.02430.02100.00020.01550.01370.06040.00080.08450.06880.01650.01100.14020.0423

GST0.25330.09390.34800.06850.17520.09770.10790.09020.00340.04270.05080.19290.01280.22330.18020.06830.04300.44280.1650

3讨论与结论

RAPD标记是显性标记,每条RAPD谱带对应基因组一个位点。我们采用18个有效引物扩增出129条带,就相当于对基因组的129个位点进行了检测,其中群体水平平均多态位点比率为61.88%,高于Hamrick和Godt于1989年对449种

植物的等位酶研究资料进行统计所确定的居群水平的遗传变异情况(居群水平平均

平均

多态位点比率为34%)[12],说明在长期的进化过程中,各群体形成并保存了较高的遗传变异水平。从位点数来看,二者共同拥有的位点很多(见表3),由Shannnon信息指数群体间多样性比率和Nei指数所得的遗传分化系数(GST)很小,分别为0.1704,0.1650,证明两群体间的遗传差异很小,遗传多样性主要存在于群体内(见表4,5)。而二者的位点数又有差异,未放牧样地群体拥有的位点,放牧样地群体却不拥有;反之,放牧样地群体拥有的位点而未放牧样地群体又不存在(见表3)。尽管某些特异位点的等位基因频率小于0.1,但部分特异性位点的等位基因频率还是很高,说明放牧压力使大针茅群体的少数位点缺失、突变或有新位点出现。通过试验发现放牧样地大针茅产生植株变矮,大、中、小丛幅都显著减小,营养枝和生殖枝减少,种子长、芒柱长变短等“小型化现象”。说明大针茅放牧后不仅个体小型化,且有性繁殖降低。

第5期张红梅等　放牧压力下大针茅群体遗传多样性的RAPD分析・189・

王炜等[13]认为长期过度放牧是形成小型化个体的原因。植物的表型是由其本身的遗传特性所决定的,环境条件具有修饰作用。“小型化现象”在过渡放牧等扰动作用下表现为具有一致性特点的集体行为,而且

小型化个体未因停止扰动而立即恢复成正常个体,这就表现为一种保守的生态习性,并且这种保守性在大针茅的正常化过程中表现得最明显(大针茅正常化过程需要7年时间)。放牧样地群体仅围封2年,所以某些位点的突变或出现都存在。未放牧样地群体和放牧样地群体的基因流(Nm)为2.5302,遗传一致度为0.9043,证明二者的群体间遗传变异很小,且两群体相邻,有可能增大了基因流,但过牧压力导致某位点发生变化的影响还是存在,这与恽锐等[5]通过对比不同年龄组的辽东栎RAPD数据,发现人为干扰对辽东栎的遗传结构有一定的影响是一致的。因个体的生态学表现为扰动响应型,所以位点的变化并不稳定,会随时间的延长而消失。因此,对于退化草地,只要采取合理的草地利用措施,减轻放牧压力,给大针茅群体一休养生息的机会,草地就有恢复生机的潜能。

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DetecitionofGeneticDiversityinStipagrandisonGrazingPressurebyUsingRAPDMarkers

ZHANGHong-mei1,ZHAOMeng-li2,LIQing-feng2,HANBing3,

YANGJie4,SuJia-lou5,ZHANGChun-Jiang5

(1.JiaxingAcademyofAgriculturalScience,Jiaxing314016;2.CollegeofEcologyandEnvironment,InnerMongoliaAgricultural

University,Huhhot010019;3.DepartmentofBiology,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018;

4.CollegeofLifeScience,InnerMongoliaUniversity010021;5.Xilinhaotegrasslandstation026000)

Abstract

　　Stipagrandisisoneofthemostimportantforageintypicalsteppe.IthasthebroadestdistributioninInnerMongolia.RandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)analyseswasusedtoestimatethege2neticdiversityandexploreconnectionofgrazingintensityandgeneticvariationofS.grandis.Atotalof18primerswereusedtodetectedgrazingpopulationandCK.Thepolymorphicproductspercentagewas81.40%,testifiedindividualexistveryhighgeneticvariation.Therewereparticularlociintwopopula2tions.Overgrazingpressurecausesomelocichange,butgeneticvariationmostlyexistinintra-popula2tion(geneticidentityis90.43%).

　　KeyWords:Stipa.grandis;RAPD;geneticdiversity