不同光质光对葡萄愈伤组织增殖和白藜芦醇含量的影响

１０６　植物生理学通讯第４４卷第１期，２００８年２月　不同光质光对葡萄愈伤组织增殖和白藜芦醇含量的影响　张真　，李胜　，，李唯　，刘媛ｌ＇　，吴兵　，－，张青松　，李婷１，２　‘甘肃农业大学生命科学与技术学院植物组织培养研究室，兰州７３００７０；　兰州汇通生物科技有限公司，兰州７３００００　提要：研究不同光质影响‘黑比诺’种子诱导并继代１０个月的葡萄愈伤组织增殖及白藜芦醇含量的结果表明：不同光　质下愈伤组织的增殖顺序依次为黄光＞绿光＞红光＞蓝光＞白光；白藜芦醇的含量依次为白光＞黄光＞红光＞蓝光＞绿光：白　藜芦醇的生产量是白光＞黄光＞红光＞蓝光＞绿光。　关键词：葡萄；愈伤组织；光质；白藜芦醇；增殖　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｌｉｇｈｔ　Ｑｕａｌｉｔｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃａｌｌｕｓ　ｆｒｏｍ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　Ｌ．ａｎｄ　Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｅｎ‘　，ＬＩ　Ｓｈｅｎｇ‘’　’，ＬＩ　Ｗｅｉ。，ＬＩＵ　Ｙｕａｎ‘　ＷＵ　Ｂｉｎｇ‘　ＺＨＡＮＧ　Ｑｉｎｇ．Ｓｏｎｇ‘　，ＬＩ　Ｔｉｎｇ‘・　，，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；　２ａｎｚｈｏｕ　ＨｕｉｔＬｏｎｇＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ．，Ｌａｎｚｔｗｕ　７３００００，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｌｉｇｈｔ　ｑｕａｌｉｉｔｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｕｌｉｔｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅ　ｔｃａｌｌｕｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｅ　ｔｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｖ／ｆ　ｖｉｎｉｆｅｒａ‘Ｐｉｎｏｔ　Ｎｏｉｒ’ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　１０　ｍｏｎｔｈｓ．ａｎｄ　ｈｅ　ｔｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈａｔｔｔｈｅ　ｉｌｇｈｔ　ｑｕａｌｉｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｈｅ　ｔｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｈｅ　ｔｏｒｄｅｒ　ｏｆｙｅｌｌｏｗ＞ｇｒｅｅｎ＞　ｒｅｄ＞ｂｌｕｅ＞ｗｈｉｔｅ．ｂｕｔａｓｆｏｒ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅ　ｃａｌｉｗｅｒｅｉｌｎｔｈａｔｏｆｗｈｉｅ＞ｙｅｌｔｌｏｗ＞　ｒｅｄ＞ｂｌｕｅ＞ｇｒｅｅｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ；ｃａｌｌｕｓ；ｌｉｇｈｔ　ｑｕａｌｉｔｙ；ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ；ｍｕｌｉｔｐｌｉｃａｔｉｏｎ　白藜芦醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏ１）化学名为芪三酚，是一　种主要存在于葡萄叶表皮和浆果果皮中的多酚类化　合物，在藜芦、虎杖、桑子、花生、风梨等　７０多种植物中也含有（向阳等２００３；陈雷和韩雅　珊１９９９），以葡萄皮中含量为最高，达到５０　１００　每瓶接种５块大小一致的愈伤组织，分别置　于白（４１０￣６９０　ｎｍ）、红（６６０　ｎｍ）、黄（５８０　ｎｍ）、　绿（５２５　ｎｍ）和蓝（４３５　ｒｉｍ）５种光质的培养箱中培　ｇ．ｇ。（Ｄｗ）。它以游离态（顺式、反式）和糖苷结　合态（顺式、反式）两种形式存在，无味、白色粉　末，完全溶解于有机溶剂。是一种天然的抗氧化　和植物抗毒素。有多种医疗效用，近年来，欧　美各国已将其开发成保健食品上市，国内也出现　了一些白藜芦醇产品，但市场缺口较大，用细胞　培养的方法生产可能是一种有效的途径。因此，　本文研究了不同光质光对葡萄愈伤组织增值和白藜　芦醇含量的影响。　养，各种光源均系冷光源，不同光源的主要技术　参数见表１，培养温度为（２６￣２）℃（李胜等２００５）。　每处理重复１　０瓶。　表１不同光质光的主要技术参数　Ｔａｂｌｅ　１　ＭａｊｏｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔＵｇｈｔｑｕａｌｉｉｆｅｓ　材料与方法　以葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　Ｌ．）品种‘黑比诺’　（‘Ｐｉｎｏｔ　Ｎｏｉｒ’）种子诱导并继代１０个月的葡萄愈　伤组织为实验材料。将继代的愈伤组织接种于增　殖培养基Ｂ　１．０　ｍｇ・Ｌ　ＫＴ＋０．５　ｍｇ・Ｌ　ＮＡＡ＋０．２５　收稿　２００７．１１．０５　修定　２００８．０１．１０　资助　科技部中小企业创业基金（０６Ｃ２６２２６２０１　８５８）、甘肃　省科技攻关项目（２ＧＳ０６４．Ａ４１．００２．０９）、甘肃省高校　研究生导师项目（０６０２．０１）、兰州市高层次人才项目　（０６－００７）。　ｇ．Ｌ。酪蛋白。所有培养基均附加２％蔗糖和０．６％　琼脂，ｐＨ　５．８，１２１℃下高压灭菌２０　ｍｉｎ。　＋　通讯作者（Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｓｈ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｔｅｌ：０９３　１—　７６３１　５４７）。　维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯第４４卷第１期，２００８年２月　ｌ０７　接种４５　ｄ后取出所有的愈伤组织，将相同处　１０　ｍｉｎ　过滤　收集所有滤液。　理的愈伤组织合并，称其鲜重，然后置于８０℃　白藜芦醇含量采用日本岛津高效液相色谱仪　恒温烘箱内烘至恒重并称重，研磨至粉末状，过　（Ｐａｓｃｕａｌ—Ｍａｒｔｉ等２００１）测定分析。采用Ｃ１８（１５０　６０目筛后，精确称取４　ｇ，转移至１５０　ｍＬ三角　ｍｍｘ４．６　ｍｍ）色谱柱，流动相采用乙腈一重蒸水　瓶中后，按照以下步骤提取：愈伤组织粉末　（ＣＨ３ＣＮ—Ｈ２Ｏ）（１５％：８５％）混合溶剂进行洗脱，流速　１００　ｍＬ乙酸乙酯３０℃，１　ｈ　过滤　５０　ｍＬ乙酸　为０．８　ｍＬ・ｍｉｎ一，检测波长为３０３　ａｍ，每次进样　乙酯３０℃，０．５　ｈ　过滤　２０　ｍＬ乙酸乙酯３０℃，　２０　Ｌ，柱温为３０℃（图１）。　量　看　馨　Ｏ　加培埔　Ｏ　Ｏ　０　Ｏ￡ｊ加　Ｏ　Ｏ８　６　　Ｏ　０　Ｏ２　　Ｏ　保留时间／ｍｉｎ　图ｌ白藜芦醇标准样品和样品的色谱图　Ｆｉｇ．１　Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｃｕｒｖｅｓ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓａｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｔｅｓｔ　ｓａｍｐｌｅ　绘制标准曲线时，精确称取５．０　ｍｇ　９９％白　６．ｏｏ　藜芦醇标准样品，用乙酸乙酯溶解并定容至５０　５．００　ｍＬ。分别准确吸取上述标样溶液０．１０、０．６２５、　１．２５、２．５０、５．０　ｍＬ，均用乙酸乙酯定容至１０　４．００　妊　ｍＬ，制成浓度依次为０．００１、０．００６２５、０．０１２５、　０．０２５、０．０５　ｍｇ．ｍＬＪ的标准溶液。依次取２０　Ｌ　翥３．００　奢　进样，每个浓度重复３次。在上述色谱条件下分　２．００　析，以白藜芦醇测定的峰面积（ｙ）为纵坐标，以对　１．００　照品进样量（　Ｌ）为横坐标（　）进行线性回归，得到　回归方程ｙ＝ａｘ＋ｂ。根据上述标准曲线绘制方法，　０　白光　红光　黄光　绿光　董光　得到回归曲线为ｙ＝１５１６２１ｘ，Ｒ２＝０．９９３５。样品中　自藜芦醇含量按下式计算：白藜芦醇含量（ｍｇ．ｇ　）＝　图２不同光质光对愈伤组织增殖的影响　【５（ｙ—ｂ）ｌａ］ｌｍ　为愈伤组织干重）。葡萄愈伤组织　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｌｉｇｈｔ　ｑｕａｌｉｉｔｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｍｕｌｉｔｐｌｉｃａｔｉｏｎ　增殖倍数和含水量分别按下式计算：接种量　．瓶　）＝＝　接种后瓶重一接种前瓶重；收获量（ｇ．瓶Ｊ）＝收获　前瓶重一收获后瓶重；增殖倍数＝收获量，接种　不及单色光。增殖效果从高到低依次为黄光＞绿　量：含水量＝【（愈伤组织湿重一愈伤组织干重），’愈　光＞红光＞蓝光＞白光。　伤组织湿重】×１００％。　２不同光质光对葡萄愈伤组织中白藜芦醇含量和　生产量的影响　实验结果　由图３可见，不同光质光下生长的葡萄愈伤　１不同光质光对葡萄愈伤组织增殖的影响　组织中自藜芦醇含量不同。其中自光条件下的愈　图２显示，黄光下，葡萄愈伤组织生物量增　伤组织中自藜芦醇的含量最高，达到３８．０　・ｇ一，　加５．７倍，说明黄光能有效促进愈伤组织的生长。　黄光下（２２．１　ｌｘｇ・ｇＪ）次之，红光下（１１．７　・ｇ　）和蓝　虽然白光也能够促进细胞的增殖（约４倍），但效果　光下（１１．１　・ｇＪ）的含量更低一些，而绿光下只检　维普资讯 http://www.cqvip.com ｌ０８　植物生理学通讯第４４卷第１期，２００８年２月　Ｉ－暑．１ＴＩ／●姐蕾极糠皿　∞　∞　∞　加　０　．　讨　论　埔　¨　白光　红光　黄光绿光　苴光　图３不同光质光对愈伤组织中自藜芦醇含量的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｉｇｈｔ　ｑｕａｌｉｔｉｅｓ　ｏｎ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｌｕｓ　测到痕量，表明绿光不利于白藜芦醇的合成。白　藜芦醇的含量大小依次为白光＞黄光＞红光和蓝光＞　绿光。由此可见，对于提高葡萄愈伤组织中白藜　芦醇来说，复合光比单色光更适宜。　在几种不同光质中，白光条件下的白藜芦醇　生产量（平均每瓶的白藜芦醇生产量）最高。对于　细胞生长的促进效应来说，白光较差，但比蓝　光、红光、黄光和绿光有明显的促进，差异达　极显著水平（图４）；与此相反，虽然绿光能有效　促进愈伤组织的增殖，但白藜芦醇的合成和累积　却受抑。就其产量而言，白光下最佳（１６．９　・瓶Ｊ），　黄光下次之（９．９　１．ｔｇ．瓶　），红光和蓝光条件下更低　些，两者之间差异不显著，绿光对白藜芦醇生产　来说为无效光。　白光　红光　黄光绿光　苴光　图４不同光质光对愈伤组织中自藜芦醇产量的影响　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｄｆｅｒｅｎｔ　ｌｉｇｈｔ　ｑｕａｌｉｉｔｅｓ　Ｏｉｌ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｔｅ　ｃａｌｌｕｓ　图中大写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），小写字母表示差异　达极显著（Ｐ＜０．０１）。　不同波长光作为一种物理因子已广泛地应用　于植物组织培养过程中的形态发生、生长控制、　光形态建成及其各种反应机制的研究（Ｓｅｉｂｅｒｔ等　１９７５）。不同光质光对植物愈伤组织、器官及原　生质体培养过程中的生长、分化、代谢与基因表　达等也有一定程度的影响（Ｄｅ　Ｃａｐｉｔｅ　１９５５；崔堂　兵等２００１）。不同光质光对植物组织培养中愈伤组　织的诱导和器官的发生已多有报道，但对植物次　生代谢产物形成和积累影响的报道尚少（冯敏等　１９９４）。本文中，白光不利于葡萄愈伤组织的生　长但有利于白藜芦醇的积累，可能与白光光照能　影响细胞分裂素的形成有关，这与张泽岑和王能　斌（２００２）的实验结果一致；黄光对于愈伤组织的　增殖效应最大，而对白藜芦醇的积累效应仅次于　白光；虽然绿光的增殖效应也较好，但细胞内未　检测到白藜芦醇。　自从Ｓｅｉｂｅｒｔ和Ｋａｄａｄｅ（１９８０）报道光可提高愈　伤组织生长以后，这方面的报道不多，不同实验　室所得到的结果并不一致，且互相矛盾甚至有相　反的情况，因此在植物组织培养过程中，仅注意　光的波长是不够的，还应注意光的幅射强度、光　照时间、外植体本身的生理生化与发育年龄一致　性等问题。　参考文献　陈雷。韩雅珊（１９９９）．葡萄不同品种和组织白藜芦醇含量的差异．　园艺学报，２６（２）：ｌ１８－ｌ１９　崔堂兵，郭勇，林炜铁（２００１）．提高植物细胞培养法生产次级代　谢物产量的方法．植物生理学通讯，３７（５）：４７９－－４８２　冯敏，毛学文，陈荃（１９９４）．不同光质和培养基对毛地黄叶组织　中强心苷累积的效应研究．韶关大学学报（自然科学版），ｌ５　（４）：７０－７３　李胜，李唯，杨德龙，武季玲，杨宁，曹孜义（２００５）．不同光质对葡　萄试管苗根系生长的影响．园艺学报，３２（５）：８７２—８７４　向阳，张彤，张煊，马龙（２００３）．高效液相色谱法测定葡萄皮和葡　萄籽中白藜芦醇的含量．卫生研究，３２（５）：４９０－－，４９２　张泽岑，王能斌（２００２）．光质对茶树花青素含量的影响．四川农　业大学学报，２０（４）：３７—３８２　Ｄｅ　Ｃａｐｉｔｅ　Ｌ（１９５５）．Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ａｍ　Ｊ　Ｂｏｔ，４２：８６９－８７３　Ｐａｓｃｕａ１．Ｍａｒｔｆ　ＭＣ。Ｓａｌｖａｄｏｒ　Ａ，Ｃｈａｆｅｒ　Ａ，Ｂｅｒｎａ　Ａ（２００１）．　Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｆｒｏｍ　ｇｒａｐｅ　ｓｋｉｎ　ｏｆ　Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＨＰＬＣ．Ｔａｌａｎｔａ，５４：　７３５－７４０　Ｓｅｉｂｅｒｔ　Ｍ，Ｋａｄａｄｅ　ＰＧ（１９８０）．Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　ｆａｃｔｏｒ：ａ　ｌｉｇｈｔ．Ｉｎ：　Ｓｔａｂａ　ＥＪ（ｅｄ）．Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｓ　Ａ　Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ．１２３－１４１　Ｓｅｉｂｅｒｔ　Ｍ，Ｗｅｔｈｅｒｂｅｅ　ＰＪ，Ｊｏｂ　ＤＤ（１９７５）．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｉｍｉｓｔ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｔｒａｌ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｎａｄ　ｓｈｏｏｔ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｉｎ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｃａｌｌｕｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。（５６）：ｌ３０－１３９