２００９年４月 中国比较医学杂志 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ａｐｆｉｌ，２００９ Ｖ０１．１９ Ｎｏ．４ 、 、 、 ｅ ） 第ｌ９卷第４期 （ 、 、 ； 、 ； ；；＼ 研究报告￥ ＣＤ４＋Ｔ细胞 大鼠心肌缺血再灌注损伤中诱导 达 募集的趋化因子的表 吴 琼 ，翟 原 ，焦守恕 ，孟 霞 ，卢 静 ，乔 欣 ，王 钜 （１．首都医科大学实验动物科学部，北京 １０００６９；２．加州大学洛杉矶分校医学院外科学系器官移植中心，洛杉矶ＣＡ９１３２０） 【摘要】 目的检测大鼠心肌缺血再灌注中诱导ＣＩＭ＋Ｔ细胞趋化的趋化因子的表达。方法．建立大鼠心 肌缺血再灌注损伤的实验动物模型，冠状动脉左前降支结扎４５ ｍｉｎ后恢复再灌，在不同的再灌注时间点Ｏ、２、６、９、 １２ ｈ获取心脏组织（每组４只），相应时间点的假手术组作为对照。ＲＴ－ＰＣＲ检测趋化ＣＤ４＋Ｔ细胞的趋化因子的表 达；免疫荧光检测趋化因子诱导的ＣＤ４＋Ｔ细胞的募集；组织学评价心肌细胞的损伤。结果诱导ＣＤ４＋Ｔ细胞募 集的趋化因子的表达在再灌注２ ｈ即迅速增高，随后出现下降。其中，ＣＸＣＬ－１０（ＩＰ．１０）的表达高峰出现在２ ｈ，与其 共用同一受体ＣＸＣＲ３的其它两个趋化因子ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）和ＣＸＣＬｌｌ（Ｉ－ＴＡＣ）的表达，分别在再灌注１２ ｈ和９ ｈ出现另 一高峰。受趋化因子的诱导，组织中浸润的ＣＤ４＋Ｔ细胞逐渐增多；心肌的缺血再灌注损伤也随之不断加重。结 诱导ＣＤ４＋Ｔ细胞募集的趋化因子，通过ＣＤ４＋Ｔ细胞介导的免疫损伤作用，最终导致了心肌的梗死。 论【关键词】 心肌缺血再灌注损伤；趋化因子；致炎性因子；ＣＩＭ＋Ｔ细胞；大鼠 【中图分类号】Ｒ３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７１．７８５６｛２００９）０４．００３８—０４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｒａｔｓ ＷＵ Ｑｉｏｎｇ ，ＺＨＡＩ Ｙｕａｎ２，ＪＩＡＯ Ｓｈｏｕ—ｓｈｕ ，ＭＥＮＧ Ｘｉａ ，Ｌｕ Ｊｉｎｇ ，ＱＩＡＯ Ｘｉｎ ，ＷＡＮＧ Ｊｕ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｒｉｎｇ １０００６９，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｕｍｏｎｔ—ＵＣＬＡ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ＵＣＬＡ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ ９１３２０，ＵＳＡ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆｏｒ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅＢｓ ｉｎ ｒａｔ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｄｕｒｉｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ（ＩＲＩ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ｒａｔ ＩＲＩ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｌｉｇａｔｍ＇ｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｂｒａｎｃｈ ｏｆ ｌｅｆｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｆｏｒ ４５ ｒａｉｎ．Ｔｈｅ ｈｅａｒｔｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ：０，２，６，９，１２ ｈ（４ ｒａｔｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ）．Ｓｈａｍ—ｏｐｅｒａｔｅｄ ｈｅａｒｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ ｔｈｏｓｅ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆｏｒ ＣＩＭ＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ ｉｎｊｕｒｙ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ．Ｒｅｓｕｌｔ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｆｏｒ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｓ ｅａｒｌｙ ａｓ ａｔ ２ ｈ ａｆｔｅｒ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｌｉｎｅｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ．ＣＸＣＬ－ＩＯ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｅａｋｅｄ ａｔ ２ ｈ ｐｏｓｔ－ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｗｏ ｍｅｍｂｅｓｒ ｏｆ ｈｔｅ ＣＸＣＲ３ ｌｉｇａｎｄ ｆａｍｉｌｙ，ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）ａｎｄ ＣＸＣＬｌ１（Ｉ－ＴＡＣ），ｈａｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｐｅａｋｓ ａｔ ｂｏｔｈ ９ ｈ ａｎｄ １２ ｈ ｐｏｓｔ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ａｌｏｎｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．ｂｏｔ｝ｌ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｗａｓ ｉｎｃｌ￣ａｆｌｅｄ ａｎｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｗａｓ ａｇｇｒａｖａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ＩＲ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＩＭ—ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｐｌａｙ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｍｙｏｃａｒｄｉｌａ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ（Ｍｉｎｉ）；Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ；Ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｙｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ；ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ；Ｒａｔ ［作者简介］吴琼（１９８２一），女，硕士研究生。研究方向：心肌缺血再灌模型的建立及免疫损伤机理研究。 ［通讯作者】王钜，教授。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｊｕ＠ｃｃｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 中国比较医学杂志２００９年４月第ｌ９卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ ＣｏｍｐＭｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２００９，Ｖｏ１．１９．Ｎｏ．４ ３９ 心肌的缺血再灌注损伤，源于短暂的血供中断， 是心功能障碍的最常见原因，也是许多心外科手术， 如冠脉再通、心力衰竭、心脏移植的必然后果。现在 察心肌不同区域的损伤程度。 １．２．４免疫组化：组织切片脱水后，经３％Ｈ＇０，孵 育、抗原修复后，滴加抗大鼠ＣＤ４＋Ｔ细胞的单克隆 一的研究表明，心肌的缺血再灌注损伤，尽管无外源性 抗原的参与，但仍然是一个以免疫反应为主的炎症 反应“ ，宿主细胞表面ＴＬＲ４（Ｔｏｌ１．１ｉｋｅ ｒｅｅｅｐｔｏｒ ４）的 抗及抗大鼠中性粒细胞的多克隆一抗，４℃过夜。 ＰＢＳ缓冲液充分冲洗后，ＦＩＴＣ荧光标记的马二抗孵 育１ ｈ，Ｈｏｅｃｈｓｔ染核。不加一抗及一、二抗均不加分 活化在心肌的缺血再灌注损伤中发挥了重要作 用 一ｓ ３。ＴＬＲ４激活后，通过特定的信号转导通路， 别作为阴性对照。随机选取ｌ０个视野，４０倍镜下 计数每个再灌注时间点的细胞数。 促进了相关细胞因子／趋化因子表达的上调，导致了 随后炎性细胞的募集和心肌细胞的损伤。在之前的 实验中，已监测到ＣＤ４＋Ｔ细胞的浸润。本文将研 究趋化因子在心肌缺血再灌注损伤中的表达及其对 ＣＤ４＋Ｔ细胞的趋化作用。 １材料和方法 １．１材料 １．１．１实验动物：Ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠，２４０～２６０ ｇ，来源 于首都医科大学实验动物科学部（生产许可证号： ＳＣＸＫ（京）２００５—０００６）。无菌手术在首都医科大学 实验动物科学部屏障动物实验设施进行（使用许可 证号：ＳＣＸＫ（京）２００５．００２２），并按实验动物使用的 ３Ｒ原则给予人道的关怀。 １．１．２仪器及材料：ＨＸ．３００小动物呼吸机、ＢＬ一４２０Ｆ 生物机能实验系统为成都泰盟科技有限公司产品， 定量ＰＣＲ仪为Ｂｉｏ Ｒａｄ公司产品。抗大鼠ＣＤ４＋Ｔ 细胞的单克隆一抗和抗大鼠中性粒细胞的多克隆一 抗由加州大学洛杉矶分校医学院外科学系翟原教授 赠予；ＦＩＴＣ荧光标记的马二抗、Ｈｏｅｅｈｓｔ购自中杉金 桥；Ｔｒｉｚｏｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｑＲＴ．ＰＣＲ ｋｉｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。 １．２方法 １．２．１心肌缺血再灌注损伤的动物模型：术前禁食 １２ ｈ后，１０％水合氯醛（０．４ ｍＬ／１００ ｇ）麻醉。颈部气 管插管，并连接呼吸机，参数为：呼吸频率６０次／ ｍｉｎ；呼吸比２：３；潮气量为９ ｍＬ。连接心电导联，记 录ＩＩ导联心电图。腋下横切口，依次剪开皮肤、皮 下组织、胸前肌肉及筋膜，暴露心包。撕开包膜，在 左心耳下方２ １／１１／１处穿线结扎，再次记录心电并闭 合胸腔。缺血４５ ｍｉｎ后，恢复再灌，三次记录心电。 分别于再灌０、２、６、９、１２ ｈ麻醉处死取材。 １．２．２ Ｔｒｃ染色梗死心肌：在不同的再灌注时间点 进行心脏灌流，并取材。以左房下缘为起始点，连续 １ ｃｍ切片进行Ｔｒｃ染色，１０％丙酮固定。 １．２．３组织病理学：心肌组织经４％的多聚甲醛固 定、石蜡包埋后，冠状位５肚ｎｌ连续切片。ＨＥ染色观 １．２．５定量ＲＴ．ＰＣＲ：切取组织后，迅速投人液氮冷 冻，并保存于一８０￣Ｃ冰箱。Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，琼脂 糖电泳检测其完整性，分光光度计测其纯度。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｑＲＴ．ＰＣＲ ｋｉｔ进行反转录及定量。 引物通过Ｐｒｉｍｅｒ３ Ｏｆｆ ｌｉｎｅ设计，上海生工合成。ｑＰＣＲ 反应体系：２０ ，９５℃预变性１０ ｍｉｎ，９５℃２０ ｓ，６３℃ ３０ Ｓ，４０个循环。引物序列：Ｊ３．ａｃｔｉｎ（ｓ：ｔｇｃｃａａ ｃａｅａｇｔｇｅｔｇｔｅｔｇ；ａｓ： ），ＣＸＣＬ．１０（Ｓ： ｃｃａａｃｃｔｔｃｃａｇａａｇｃａｃｃａｔ；ａｓ：ａｅｅｇｔｔｅｔｔｇｅｇａｇａｇｇｇａｔ），ＣＸＣＬ一９ ＣＸＣＬ－１ １（Ｓ：ｇｅｔｅａｔａａａｇｇａｅａａａｇｇｔｇｅｅ；ａｓ：ａｅａｇｇａｇａｇｇｇｔｅａ ｇｃｔｔｅｔｔ），ＭＩＰ－２（ｓ：ａｅｔｅｔｔｔｇｇｔｅｅａｇａｇｅｅａｔｇ；ａｓ：ｔｇｇｔａｇｇｇ ｔｅｇｔｅａｇｇｅａｔｔ）。 １．３统计学方法 所有的数值都用Ｖ±ＳＤ的方法表示，Ｏｎｅ—ｗａｙ ＡＮＯＶＡ方差分析假手术组与各不同再灌注组间细胞 计数的差异，Ｅｘｃｅｌ统计各趋化因子／致炎性因子的表 达，Ｌｅｉｅａ Ｑｗｉｎ图像分析软件进行梗死面积分析。 ２结果 ２．１心肌梗死面积分析 取各心肌组织的同一水平面进行梗死面积的图 像分析，结果如图１所示，心肌梗死面积随着缺血再 灌注时间的延续而扩大，在再灌注１２ ｈ达到最大。 暑 ３ 旧 路 基 图１不同缺血再灌注时间点的心肌梗死面积 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｒｅａｓ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｏｓｔ— ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ２．２心肌缺血再灌注损伤的病理变化 为进一步观察心肌的缺血再灌注损伤，进行了 中国比较医学杂志２００９年４月第ｌ９卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ ＣｏｍｐＭｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２００９，Ｖｏ１．１９．Ｎｏ．４ ０ｏ 口ｊ口 如 ∞ 如 加 ｍ ０ ● ： ・ ● ｓｈａｍ １Ｒ０ ｈ ＩＲ２ ｈ ＩＲ６ｈ ＩＲ９ ｈ ＩＲ１２ ｈ ｓｈａｍ Ｉ Ｒ（】ｈ Ｉ． ．ｉ．Ｉｉ ＩＲ２ ｈ ＩＲ６ ｈ ＩＲ９ｈ ＩＲ１２ ｈ ＣＤ４（时）ｈｏｕｒ ＰＭＮ（时１ ｈｏｕｒ 注：＊表示与假手术组相比，再灌注不同时间点的细胞计数有统计学差异，Ｐ＜０．０５ Ｎｏｔｅ：＊ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐｓ（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ，Ｐ＜Ｏ．０５） 图３假手术组及再灌注不同时间组浸润的ＣＤ４＋Ｔ细胞和ＰＭＮ细胞计数 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ＣＤ４＋Ｔ ａｎｄ ＰＭＮ ｃｅＵｓ ｉｎ ｓｈａｍ—ｏｐｅｒａｔｅｄ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ 病理组织学检测。ＨＥ染色的结果显示（图２，见彩 插２），正常区域的心肌细胞显示清晰的组织结构， 梗死边缘区（即风险区）的心肌纤维变性、水肿，并有 不同程度的细胞凋亡（表现为细胞形态及核形态的 改变：细胞皱缩，核由长梭形核变成圆形），梗死区的 心肌纤维红染，细胞坏死，核固缩或碎裂，伴有或不 伴有程度不等的出血及炎性细胞浸润。因此，挽救 边缘区心肌细胞，避免其坏死是防止心肌缺血再灌 注损伤进行性加重的有效手段。 ２．３缺血再灌注心肌组织中ＣＤ４＋Ｔ细胞及中性 ∞∞加砷卯∞如 ｍ Ｏ ｏ 口 口 值出现在再灌注２ ｈ，而ＣＸＣＬ一９则在再灌注２ ｈ、 １２ ｈ时高表达，峰值出现在１２ ｈ。 Ｉ，Ｒ０ｈ Ｉ／Ｒ２ ｈ ＵＲ６ ｈ Ｉ／Ｒ９ ｈ Ｉ／Ｒ１２ ｈ 粒细胞的浸润 在ＨＥ染色中，已明确观察到了炎性细胞的浸 时间Ｉ／Ｒｔｉｍｅ 润，为了确定浸润的炎性细胞的类型，进行了免疫组 织化学荧光染色。与心肌梗死面积的变化趋势一 致，心肌组织中浸润的ＣＤ４＋Ｔ细胞，也随着再灌注 时间的延续而增多。如图３所示，ＣＤ４＋Ｔ细胞的 图４与ＣＸＣＲ３结合的趋化因子在心肌缺血再灌注不 同时间点的表达 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＸＣＲ３ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｅｙｔｅｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ 浸润在再灌注９ ｈ时迅速增高，在１２ ｈ时趋于稳定， 且均与假手术组有明显的统计学差异。而中性粒细 胞的浸润则在再灌注２ ｈ即达到高峰。 ２．４与ＣＤ４＋Ｔ细胞表面受体ＣＸＣＲ３结合的趋 化因子的表达 ２．５趋化因子ＭＩＰ．２的表达 关于中性粒细胞在心肌缺血再灌注损伤中的作 用，在各种不同的实验中已得到了证实。因此，检测 其趋化因子ＭＩＰ一２在不同再灌注时间点的表达是必 要的。如图５所见，ＭＩＰ一２在再灌２ ｈ和９ ｈ有明显 究竟是什么原因导致了ＣＤ４＋Ｔ细胞在炎症部 位的浸润呢？首先检测对其有趋化作用的ＣＸＣＲ３ 趋化因子的表达，即检测ＣＸＣＬ９、１０、１Ｉ在不同缺血 的高表达。此外，值得注意的是，ＭＩＰ一２的高表达极 大地被诱导了，与再灌各组形成鲜明的对照。 ３讨论 再灌注时间点的表达。以Ｇ—ａｃｔｉｎ作为管家基因，计 算随再灌注时间的延续，ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ． １０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）表达的变化。如图４所示，这三 ３．１与ＣＩＭ＋Ｔ细胞表面受体ＣＸＣＲ３结合的趋 化因子介导了心肌缺血再灌注损伤 个基因的表达均在缺血再灌后迅速增高，随后又迅 速下降。ＣＸＣＬ一１０的表达在再灌２ ｈ达到高峰后迅 现在认为，ＴＬＲｓ介导的固有免疫反应是心肌缺 血再灌注损伤的主要原因。ＴＬＲ下游诱导产生的趋 速下降并趋于稳定，ＣＸＣＬ一９、ＣＸＣＬ一１１的表达则出现 了双峰现象。ＣＸＣＬ一１１在再灌２ ｈ、９ ｈ时高表达，峰 化因子，通过介导炎性细胞的浸润，发挥损伤作用。 ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ一１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ）都属 ｐｌ０Ｊ ７ ６ ５ ４ ３ ２ １ Ｏ 中国比较医学杂志２００９年４月第１９卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ ＣｏｍｐＭｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２００９，Ｖｏ１．１９．Ｎｏ．４ ４１ ＭＩＰ．２ ■■＿－ 。一 Ｏ ２ ６ ＿ｌ９ １２ （时）ｈｏｕｒ 图５相关趋化因子在心肌缺血再灌注不ｌ司时间点的表达 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｔ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ 于ＣＸＣ家族的的趋化因子，是淋巴细胞的高效趋化 剂，能通过与ＣＤ４＋Ｔ细胞上的ＣＸＣＲ３受体结合，ｉ２ ３ 介 ｉ 导细胞的趋化募集 ’ ，而对中性粒细胞则没有趋 化作用。在实验中，已检测到ＣＤ４＋Ｔ细胞的浸润 以及同源性趋化因子Ｍｉｇ、ＩＰ １０和Ｉ－ＴＡＣ的诱导性 表达。根据ｑＲＴ—ＰＣＲ的结果（图４）发现，与肝脏的 缺血再灌注损伤不同¨ ，在心肌的缺血再灌注损 伤中，不仅有ＣＸＣＬ．１０的诱导性表达，也有ＣＸＣＬ一９ 和ＣＸＣＬ．１１的诱导性表达。此外，Ｍｉｇ和Ｉ－ＴＡＣ的 基因表达均出现双峰现象，这说明它们的表达存在 即时诱导和后期诱导效应。这些趋化因子可能通过 正反馈促进自身的分泌，形成有效的浓度梯度，诱导 ＣＤ４＋Ｔ细胞的浸润，从而放大这一免疫反应过程。 而且，Ｔｒｃ染色心肌梗死面积的扩大及免疫荧光染 色ＣＤ４＋Ｔ细胞浸润在再灌注９ ｈ时明显增高，１２ ｈ 时达到最高峰，进一步支持这种正反馈效应的重要 作用，但是也不能排除Ｍｉｇ和Ｉ－ＴＡＣ在不同的缺血 再灌时间发挥不同作用的可能。然而，毋庸置疑的 是，ＣＸＣＲ３的配体——Ｍｉｇ，ＩＰ．１０和Ｉ－ＴＡＣ均参与了 ＣＤ４＋Ｔ细胞介导的心肌缺血再灌注损伤。 ３．２ 中性粒细胞参与了早期的心肌缺血再灌注损伤 心肌的缺血再灌注损伤是多种因素综合作用的 结果。在实验中，除观察到与ＣＸＣＲ３结合的趋化因 子介导的ＣＤ４＋Ｔ细胞浸润外，也观察到了ＭＩＰ．２ 介导的中性粒细胞的浸润。ＭＩＰ．２也属于ｃｘｃ趋化 因子家族的成员，它作为中性粒细胞的趋化剂 “ ， 在再灌注２ ｈ即有高表达，而中性粒细胞的浸润在 再灌２ ｈ也达到最高峰（图２，图５），这至少说明在 心肌缺血再灌注损伤的早期，中性粒细胞发挥了重 要作用。 综合心肌缺血再灌注损伤的研究成果，结合本 试验的数据，可以认为心肌的缺血再灌注激活固有 免疫反应后，通过ＣＸＣＲ３趋化因子介导的ＣＤ４＋Ｔ 细胞浸润，最终导致了心肌细胞的损伤。中性粒细 胞作为一个重要的参与者，在心肌缺血再灌损伤的 早期发挥了重要作用。 参考文献： Ｎｉｋｏｌａｏｓ ＦＧ，Ｗａｙｎｅ ＳＣ，Ｍａｒｋ ＥＬ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．［Ｊ］．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ，２００２，５３（１）：３１—４７． Ｎｉｋｏｌａｏｓ ＦＧ．Ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｂａｓｉｓ 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Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｒａｅｅｌｌｕｌｒａ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＣＸＣＲ３ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ＣＸＣＬ９，ＣＸＣＬＩＯ ａｎｄ ＣＸＣＬ１１ ｆｕｎｃｔｉｏｎｌ Ｊ Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９：３０２１９—３０２２７． Ｄｕｆｏａｒ ＪＨ，Ｄｚｉｅｊｍａｎ Ｍ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔ．Ｌｉｕ ＭＴ，ｅｔ ａ１．ＩＦＮ－７－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０（ＩＰ－１０；ＣＸＣＬ１０）一ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｒｅｖｅａｌ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＩＰ－１０ ｉｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒＴ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｆｉｆｃｋｉｎｇ【Ｊｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，１６８： ３１９５—３２０４． Ｚｈａｉ Ｙ，Ｓｈｅｎ ＸＤ，Ｇａｏ Ｆ，ｅｔ ａ１．ＣＸＣＬ１０ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｉｖｅｒ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００８．４７（１）：２０７—２１４． Ｚｈａｉ Ｙ，Ｓｈｅｎ ＸＤ，Ｗａｙｎｅ ＨＷ，ｅｔ ａ１．ＣＸＣＲ３＋ＣＩＭ＋Ｔ ｃｅｉｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｖｅｒ ｉｓｅｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００６，１７６：６３１３— ６３２２． Ｎｉｋｏｌａｏｓ ＦＧ，Ｍａｒｋ ＥＬ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ【Ｊ Ｊ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ，２００５，１５：１６３—１６９． Ａｒａｋｉ Ｍ，Ｓｃｈｅｎｋ ＡＤ，Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ ＲＬ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ８：ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｉｓｅｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｊｎｕｒｙ ｌＪＪ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００４，９：１３９—１４４． （修回日期Ｊ２００８．１０．２７ ４ ［ ］ 姚洁等APP5肽对糖尿病小鼠学习记忆功能与海马神经元蛋白表达的影响。．(正文见第tionan10页n)YAOJie，eta1Ef．ectsofAPP5omerPeptideontheLearningandMemoryFuncdProteinExpressioin10)HippocampalNeuronsfDiabeticMice(FulltextonpageA：对照组：B：DM模型组；C：DM+APP5肽组图1NAPP5肽对糖尿病小鼠海马CAlgroul区P13K+表达的影响peptidegrmouote：A：controp；Bsta：DMgroup；Co：DMAPP5一merparea．Fig．1iningfP13KinthemousehippocapusCAl李金科等肝康，．Ⅳ号对脂肪肝大鼠肝组织脂质含量及形态学的影响ec(正文见第31页)LipidContentinLiverxLIJingke—，etaan1Ef．toftheChineseMedicineGaonkangIV(GKlV)onTissuedMorphologyfFattyLiverRatModels(Fulltetonpage31)图1Figwas．A组：重度脂肪肝pA：Severean图2fattylivuBl组er：中度脂肪肝．图3：B3组o：脂肪肝程度较B1减轻Fig．1lessgrouFig2groupBIMderatefatty3GroupB3：ThedegreeoffattyliversevereththatingropB1吴琼等大鼠心肌缺血再灌注损伤中诱导CD4+T细胞募集的趋化因子的表达。．(正文见第38页)WUQiong．eta1E．xpressionofChemotacticChemotkinesinCD4+TcellsduringMyocardialIschemiaReperfusionInjuryinRats(Fulltextonpage38)注：左：正常区域的心肌组织；中：边缘带的心肌组织：心肌纤维间隙增宽横纹消失；心肌细胞核固缩碎裂；右：梗死区的心肌组织：心，、肌细胞坏死轮廓不清的红染炎细胞浸润．，图2Note：leen光镜下心肌细胞的损伤otf：normalarea；Middle：bourandaryraea：wcarideningdiacfHenle’sif，ssuresamoranddisappearancesreoftranansversestriation；pyknosisandnuclearammatorycefragmtation．Right：infarctea：thenecroticmusclefibersaphoud—stainedraeasdinfiltratinginflslls．Fig．2Histologicallterationsinthemyocardialmyocyte