基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的临床应用

陈瑶;吴英松

【摘 要】目的 评价基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的效果. 方法 选取我院结核科2014年3月至2016年3月收治的涂片阳性的肺结核住院患者238例,取其痰标本,分别用基因芯片、传统的罗氏培养和药敏试验3种方法进行结核分枝杆菌的异烟肼耐药性检测和利福平耐药性检测;把罗氏培养和药敏试验的结果作为金标准,评价基因芯片技术的临床应用价值. 结果 基因芯片技术检测涂片阳性患者痰标本异烟肼耐药的情况与金标准无显著差异(P＞0.05);利福平耐药的情况与金标准相比也无明显差异(p>0.05). 结论 基因芯片能够快速、准确地检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药情况,是一种值得推广的临床实验室检测方法. 【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》 【年(卷),期】2017(009)002 【总页数】4页(P108-111)

【关键词】基因芯片技术;结核分枝杆菌;耐药性;检测 【作 者】陈瑶;吴英松

【作者单位】南方医科大学检验与生物技术学院,广东,广州510515;南方医科大学检验与生物技术学院,广东,广州510515 【正文语种】中 文

结核作为一种慢性传染病，在我国每年因结核病死亡的患者多达13万［1］。由于耐药的结核分枝杆菌增加［2］，预计将来结核病的流行态势可能会以耐药菌为

主；因此，耐药结核病的防治将会成为一项重要课题。临床上，传统的实验室检测方法有细菌培养、抗酸染色等，但是这些方法存在耗时较长、假阳性高和灵敏度低等问题［3］。基因芯片技术是近年来开展的分子生物学检测技术，时效性较传统方法要高［4］。目前，对结核分枝杆菌的检测，多以分离菌株为检测对象；以痰标本为检测对象的报道少见。从结核防治的实际出发，本研究以痰标本为检测对象，以传统的罗氏培养和药敏试验作为诊断的金标准，评估基因芯片技术对结核分枝杆菌的异烟肼和利福平耐药性的检测效果；为评价这项技术在临床上的应用提供实验依据。 1.1 一般资料

选择我院结核科2014年3月至2016年3月收治的涂片阳性肺结核住院患者238例作为研究对象。其中男128例，女110例，年龄21～65岁，平均年龄45.6±6.7岁。 1.2 采集患者的痰标本

每例患者留取清晨第一口痰标本，每人3份，每份5 mL；经检测后，留取涂片阳性级别较高（2+以上）的2份，各取1 ml混匀，进行基因芯片检测；剩下的痰标本做罗氏培养。

涂片阳性级别的判断方法：①阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；②可疑阳性：1～8条抗酸杆菌/300视野；③1+：3～9条抗酸杆菌/100视野；④2＋：1～9条抗酸杆菌/10视野；⑤3＋：1～9条抗酸杆菌/每视野；⑥4＋：≥10条抗酸杆菌/每视野。 1.3 基因芯片技术

整个检测过程大约24 h，具体流程如下： 1.3.1 样品制备

向盛有痰液的无菌盒加入4%氢氧化钠10 mL，对收集到的痰标本进行预处理；随

后进行细菌核酸提取；进行基因扩增。PCR扩增仪由博奥生物有限公司提供。 每管PCR反应体系总体积为20 μL，其中Mtb分离株DNA模板为2 μL，PCR扩增试剂1、PCR扩增试剂2和PCR扩增试剂3各18 μL。PCR产物1为对照产物，与两种微阵列都进行杂交。PCR产物2为rpoB基因的扩增产物，与利福平微阵列相对应；PCR产物3为katG基因及inhA基因启动子的扩增产物，与异烟肼微阵列相对应。PCR扩增程序为：37℃600 s，94℃600 s；94℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，35个循环；然后94℃30 s，72℃60 s，10个循环；最后置72℃420 s。 1.3.2 芯片反应

PCR扩增完毕，完成变性后，将产物加入Mtb耐药性检测试剂盒（北京百奥瑞生物技术有限公司提供）的芯片点阵中，完成芯片杂交反应，并洗去非特异性杂交的核酸片段。

取杂交缓冲液9 μL，分别加入同一样品的PCR产物1和PCR产物2各3 μL，或者加入PCR产物1和PCR产物3各3 μL。置于PCR扩增仪中于95℃变性5 min，然后冰浴3 min；将13.5 μL杂交反应混合物经盖片的加样孔加入，迅速盖上杂交盒并密封；放入50℃预热的恒温水浴锅中120 min；水平取出杂交盒，拆开取出芯片，洗涤后离心甩干。 1.3.3 结果判读

甩干后，将芯片载入LuxScan 10KB微阵列芯片扫描仪（博奥生物有限公司提供），判读检测结果。 1.4 传统罗氏培养和药敏试验

以传统的罗氏培养和药敏试验作为金标准，对238例患者的痰标本进行罗氏培养，阳性的痰标本做药物敏感性试验。整个过程大约2～3个月。 1.4.1 罗氏培养

在预处理之前，将痰标本接种到酸性改良的罗氏培养基上，观察菌落的生物学特点。罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司生产，规格为7 mL/支。 1.4.2 药敏试验

观察结核杆菌的菌落，取菌落接种，配制菌悬液（1 mg/mL），稀释浓度至10⁃2mg/mL和10⁃4mg/ mL，分别接种到含异烟肼（0.2 μg/mL）和利福平（40 μg/mL）的药敏培养基上，37℃培养6周，观察培养结果。 1.5 数据统计

所有的数据采用SPSS19.0处理。计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义；真实性采用灵敏度和特异度评估；可靠性用Kappa值评估，Kappa值为0.41～0.6为中度一致性，0.61～0.8为高度一致性，0.8～1.0为最强一致性。 2.1 检测的一般情况

238例患者的痰标本中，培养结果阴性15例，剩余的痰标本中，非结核分枝杆菌感染5例，耐药检测结果不完整者14例，最终纳入分析的患者为204例。初治涂片阳性155例，复治涂片阳性49例。 2.2 异烟肼耐药性检测结果

2.2.1 初治涂片阳性患者痰液结核分枝杆菌基因芯片检测对异烟肼耐药性的结果 检测结果，异烟肼耐药24例，17例为katG基因突变，7例为inhA基因突变。结果显示，与金标准相比无显著差异（P＞0.05）；对于初治涂片阳性的患者，采用基因芯片技术，灵敏度是86.67%，特异度是92.14%；kappa值为0.81，一致性为高度（表1）。

2.2.2 复治涂片阳性患者痰液结核分枝杆菌基因芯片检测对异烟肼耐药性的结果 检测结果，异烟肼耐药13例，9例为katG基因突变，4例为inhA基因突变。结果显示，与金标准无显著差异（P＞0.05）；对于复治涂片阳性的患者，采用基因芯片，灵敏度是90.91%，特异度是92.11%；kappa值为0.83，一致性为最强

（表2）。

2.3 利福平耐药性检测结果

2.3.1 初治涂片阳性患者痰液结核分枝杆菌基因芯片检测对利福平耐药性的结果 检测结果，利福平耐药32例，均为rpoB基因突变。结果显示，与金标准无显著差异（P＞0.05）；对于初治涂片阳性的患者，采用基因芯片技术，灵敏度是90.48%，特异度是91.44%；kappa值为0.85，一致性为最强（表3）。 2.3.2 复治涂片阳性患者痰液结核分枝杆菌基因芯片检测对利福平耐药性的结果 检测结果，利福平耐药15例，均为rpoB基因突变。结果显示，与金标准无显著差异（P＞0.05）；对于复治涂片阳性的患者，采用基因芯片技术，灵敏度是81.82%，特异度是84.21%；kappa值为0.790，一致性为高度（表4）。 基因是染色体上具有遗传效应的DNA片段［5］。基因芯片技术是一项新兴的现代分子生物学技术，其原理是对待测的DNA用另一个已知核酸序列的DNA按碱基互补配对的原则杂交，然后通过计算机处理，得到待测DNA的序列［6］。基因芯片技术的灵敏性和特异性都比较高，因此这项技术也逐步成为诊断疾病的尖端技术，对于指导临床合理、及时、准确地用药提供了很大的方便。

异烟肼和利福平是最主要的一线抗结核药［7］，快速检测结核分枝杆菌对这两种药物的敏感性在抗结核治疗的过程中十分重要。目前，国内外已经开始运用基因芯片技术对结核分枝杆菌的耐药性进行检测［8］，检测的对象主要是结核分枝杆菌的分离菌株。然而，临床结核防治过程中，检测的主要对象是以患者的痰为标本。考虑到这一点，本次研究收集所有患者的痰液后，对结核分枝杆菌的主要突变基因位点进行检测，如katG、inhA和rpoB等［9］，评价基因芯片技术对异烟肼和利福平耐药性检测的真实性与可靠性。

国外研究发现，与DNA测序相比，采用基因芯片技术，检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性，灵敏度达到84.1%，特异度达到100%；对利福平的耐药性分别是

100%和95.3%［10］。另外，相对于药敏试验，检测对异烟肼耐药性的灵敏度是88.59%，特异度是91.53%，对利福平耐药性分别是85.39%和88.45%［11］。本研究的检测结果显示：采用基因芯片技术，与药敏试验相比，检测对异烟肼耐药性的灵敏度和特异度分别为86.67%～90.91%和92.11%～92.14%；检测对利福平耐药性的灵敏度和特异度分别为81.82%～90.48%和84.21%～91.44%。与国外的研究结果比较接近，表明在结核防治工作中，采用基因芯片检测技术，以痰标本作为检测对象，检测结核分枝杆菌的耐药性，结果是可靠的。

Guo Y等［12］以痰标本为检测对象，用基因芯片技术检测异烟肼和利福平耐药性，同药敏试验比较，其一致性分别是80.3%和84.2%。本文的结果显示，相对于药敏试验，基因芯片技术对于异烟肼耐药检测结果的Kappa值为0.81～0.83，其一致性为最强；对于利福平耐药检测结果的Kappa值为0.79～0.85；其一致性也为最强。这同Guo Y等［12］的研究结果基本一致。上述检测结果表明，在结核临床防治工作中，采用基因芯片检测技术，以痰标本作为检测对象，检测结核分枝杆菌的耐药性，结果可靠。

综述所述，应用基因芯片技术检验结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性，真实性和可靠性都得到了实验数据的验证，在结核病的临床快速诊疗领域具有广阔的应用前景。

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